[發明專利]氨基雙去甲氧基姜黃素高產菌株構建及其發酵優化方法

有效

• 申請號: 202011374464.0
• 申請日: 2020-11-30
• 公開（公告）號: CN112481178B
• 公開（公告）日: 2022-07-26
• 發明（設計）人: 康前進;胡曉婧;歐一新;白林泉
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/66;C12N15/52;C12N15/54;C12P13/00;C12R1/19
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 胡晶

本發明涉及氨基雙去甲氧基姜黃素高產菌株構建及其發酵優化方法。本發明公開了一株以對氨基肉桂酸為底物合成氨基雙去甲氧基姜黃素的大腸桿菌工程菌株，屬于合成生物學或者代謝工程領域。本發明將4?香豆酰輔酶A連接酶基因4cl、二聚酮合酶基因dcs、姜黃素合成酶基因curs3以及乙酰輔酶A羧化酶基因accBC和dtsR1組成合成途徑轉入大腸桿菌MG1655(DE3)中，并對合成途徑進行模塊劃分及優化，得到了產量最優的一株工程菌。通過對發酵條件的優化，最終使得該菌株在以對氨基肉桂酸為底物發酵48h后，氨基雙去甲氧基姜黃素的產量達到33mg/L。本發明為高活性氨基雙去甲氧基姜黃素的工業化生產和應用奠定了基礎。

技術領域

本發明屬于代謝工程領域，涉及一種氨基雙去甲氧基姜黃素高產菌株構建及其發酵優化方法；尤其涉及一種以對氨基肉桂酸為底物合成氨基雙去甲氧基姜黃素的高產菌株構建方法以及發酵條件優化。

背景技術

姜黃素類化合物是中藥姜黃中具有藥理作用的主要活性成分，根據其結構的不同，主要分為三種：姜黃素(curcumin，C₂₁H₂₀O₆)、去甲氧基姜黃素(demethoxycurcumin，C₂₀H₁₈O₅)以及雙去甲氧基姜黃素(bisdemethoxycurcumin，C₁₉H₁₆O₄)。姜黃素類化合物具有良好的抗炎、抗腫瘤、抗氧化以及抗心腦血管活性，另一方面姜黃素在食品工業中也被廣泛用作于食品添加色素。因此該類化合物具有廣闊的應用前景。

根據前期課題組的研究，一種氨基雙去甲氧基姜黃素(NH₂-bisdemethoxycurcumin，NBMC)具有更高于天然雙去甲氧基姜黃素的抗炎能力。該化合物在此之前沒有相關報道，因此不能使用天然的植物提取方法來獲得。目前關于姜黃素類化合物的微生物發酵方法已逐漸成為該類化合物獲取的主要研究對象，具有一定的研究基礎。而氨基雙去甲氧基姜黃素的獲取，在一定程度上也為后續獲得氨基姜黃素等其他衍生產物提供了可能。

本發明是以對氨基肉桂酸為底物，通過對合成途徑進行模塊劃分及優化，使其獲得較高的氨基雙去甲氧基姜黃素的產量，并通過發酵條件的優化進一步提升了最終的產量，為后續的的大規模工業化生產提供了研究基礎。

發明內容

本發明的目的在于提供一種氨基雙去甲氧基姜黃素高產菌株構建及其發酵優化方法；本發明提供了一株高產氨基雙去甲氧基姜黃素的大腸桿菌工程菌，并通過發酵條件的優化進一步提高菌株的產量，為其工業化生產奠定了基礎。

本發明的目的是通過以下技術手段實現的。

第一方面，本發明提供一種以對氨基肉桂酸為底物合成氨基雙去甲氧基姜黃素的大腸桿菌工程菌，在大腸桿菌MG1655(DE3)中表達了合成途徑中所需的關鍵酶：4-香豆酰輔酶A連接酶4CL、二聚酮合酶DCS、姜黃素合成酶CURS3以及乙酰輔酶A羧化酶AccBC和DtsR1。

編碼所述4-香豆酰輔酶A連接酶4CL的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，編碼所述二聚酮合酶DCS的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，編碼所述姜黃素合成酶CURS3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，編碼所述乙酰輔酶A羧化酶AccBC和DtsR1的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

作為本發明的一個實施方案，通過同時使用3個載體對所述5條基因進行共表達。所述載體在以下4個拷貝數不同、抗性不同的載體中隨機組合：pRSFDuet-1(拷貝數100，Kan)、pETDuet-1(拷貝數～40，Amp)、pCDFDuet-1(拷貝數20-40，Spe)和pACYCDuet(拷貝數10-12，Chl)。