[發明專利]氨基雙去甲氧基姜黃素高產菌株構建及其發酵優化方法

有效

• 申請號: 202011374464.0
• 申請日: 2020-11-30
• 公開（公告）號: CN112481178B
• 公開（公告）日: 2022-07-26
• 發明（設計）人: 康前進;胡曉婧;歐一新;白林泉
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/66;C12N15/52;C12N15/54;C12P13/00;C12R1/19
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 胡晶

1.一種以對氨基肉桂酸為底物合成氨基雙去甲氧基姜黃素的大腸桿菌工程菌，其特征在于，在大腸桿菌MG1655 (DE3)中表達了合成途徑中所需的關鍵酶：4-香豆酰輔酶A連接酶4CL、二聚酮合酶DCS、姜黃素合成酶CURS3以及乙酰輔酶A羧化酶AccBC和DtsR1；

編碼所述4-香豆酰輔酶A連接酶4CL的核苷酸序列如 SEQ ID NO.1所示，編碼所述二聚酮合酶DCS的核苷酸序列如 SEQ ID NO.2所示，編碼所述姜黃素合成酶CURS3的核苷酸序列如 SEQ ID NO.3所示，編碼所述乙酰輔酶A羧化酶AccBC和DtsR1的核苷酸序列分別如 SEQID NO.4和SEQ ID NO.5所示；

合成路徑規劃成三個模塊，模塊Ⅰ包含4-香豆酰輔酶A連接酶基因4cl，模塊Ⅰ在質粒pACYCDuet上，模塊Ⅱ包含二聚酮合酶基因dcs和姜黃素合成酶基因curs3，模塊Ⅱ在質粒pRSFDuet上，模塊Ⅲ包含乙酰輔酶A羧化酶基因accBC和dtsR1，模塊Ⅲ在質粒pCDFDuet上。

2.一種如權利要求1所述的大腸桿菌工程菌的構建方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

（1）對所述關鍵酶的5條基因進行大腸桿菌密碼子優化并全合成；

（2）通過酶切酶連方法構建4CL表達質粒：pACYC-4CL；

（3）通過酶切酶連方法構建DCS和CURS3表達質粒：pRSF-DCS-CURS3；

（4）通過酶切酶連方法構建AccBC和DtsR1表達質粒：pCDF-AccBC-DtsR1；

（5）步驟（2）、（3）、（4）中的表達質粒，電轉化入MG1655 (DE3)感受態細胞中；

（6）對應重組質粒的抗性，對長出的菌落進行篩選，并進一步利用PCR驗證重組菌株的正確性。

3. 一種利用如權利要求1所述的大腸桿菌工程菌發酵生產氨基雙去甲氧基姜黃素的方法，其特征在于，將所述大腸桿菌工程菌接種到含有100 mL LB培養基的500 mL平底三角搖瓶中，在37℃、220 rpm條件下培養至OD600 為 0.6時，加入終濃度0.5 mM的IPTG和0.5mM的對氨基肉桂酸，在25℃、220 rpm條件下繼續培養36 h。

4. 一株大腸埃希氏菌（Escherichia coli）HXJE109，保藏編號為CGMCC NO.20984。