[發明專利]一種紫點海葵酶解多肽的制備方法及其應用

有效

• 申請號: 202011374405.3
• 申請日: 2020-11-30
• 公開（公告）號: CN112458138B
• 公開（公告）日: 2023-05-05
• 發明（設計）人: 高炳淼;袁琳;符金星
• 申請（專利權）人: 海南醫學院
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K1/34;A61K38/01;A61P35/00
• 代理公司: 海南漢普知識產權代理有限公司 46003
• 代理人: 劉建芳

本發明提供一種紫點海葵酶解多肽的制備方法及其應用，其制備方法包括以下步驟：S1、預處理：收集紫點海葵，洗凈后剪碎，超聲破碎至溶液渾濁，置于有機溶劑浸泡去脂，沖洗、瀝干，得到紫點海葵樣品；S2、海葵總蛋白的提取：取步驟S1的紫點海葵樣品，加入混合后的RIPA裂解液與PMSF蛋白酶抑制劑，靜置20?40min后超聲破碎至溶液渾濁；低溫離心，收集上清液得到粗品，真空冷凍干燥，制得海葵蛋白凍干粉；S3、酶解：取步驟S2的海葵蛋白凍干粉用純水溶解，加入堿性蛋白酶，進行酶解酶解后煮沸滅活，得到酶解產物經超濾管離心，收集濾液，冷凍干燥，制得紫點海葵多肽。本發明制得紫點海葵多肽具有高效抗腫瘤活性。

技術領域

本發明涉及多肽技術領域，特別涉及一種紫點海葵酶解多肽的制備方法及其應用。

背景技術

約100年的海葵毒液研究表明，海葵毒液是含有大量生物活性肽和蛋白質以及非蛋白質化合物的毒素混合物，分子量范圍為3000至300000，主要分為海葵神經毒素和溶細胞素。目前已經鑒定出其中約250種化合物(肽，蛋白質，酶和蛋白酶抑制劑)和非蛋白質類物質(嘌呤，季銨化合物，生物胺和甜菜堿)。中國的海葵品種約為110種，于中國沿海廣泛分布，其中南海最多，主要分布于潮間帶、西沙群島礁盤和底棲。

隨著組學技術的發展，轉錄組學、蛋白質組學和肽組學研究發現，毒液中肽毒素的多樣性似乎比預估的更為復雜。已經從海葵中分離并鑒定了100多種肽毒素，它們已經或將成為研究特定離子通道的結構和功能的重要工具。

迄今為止，海葵毒素中屬于非蛋白類物質的沙海葵毒素(PTX)毒性最強，LD₅₀為0.15μg/kg，毒性遠超過河豚毒素(LD₅₀為8μg/kg)和石房蛤毒素(LD₅₀為10μg/kg)，可使血管強烈收縮和冠狀動脈痙攣。此外大部分屬蛋白類毒素，其中又以多肽為主。由于海葵神經毒素結構新穎、靶點專一、作用效率高，是目前研究最多、也最為深入的一大類海葵毒素，使這類多肽毒素成為神經生理學和藥理學研究的重要工具而受到了更廣泛的關注。

21世紀以來，在對海洋活性化合物的探索開發過程中，活性多肽是經過深入研究的代表之一。隨著酶解法制備活性肽的研究增加，使得海洋生物資源得到了更好的發展。酶解法制備生物活性肽，提取得到的活性肽既能補充機體營養成分，又具有抗氧化、降血壓、抗腫瘤、抗凝血等活性。因此，酶解法因生產條件溫和，產品安全性高，成為制備外源肽(生物活性肽)的常見方法。

結腸癌是常見的發生于結腸部位的消化道惡性腫瘤，在我國以40～50歲年齡組發病率最高，男女之比為2～3：1，發病率占胃腸道腫瘤的第3位，而在美國，結腸癌和直腸癌的發病率似乎更高。結腸和直腸腫瘤最好的治療方法是通過適當的淋巴結清掃術以及近端和遠端的適當切緣進行手術治療，以防止局部復發。而放射治療似乎是術前或術后治療直腸癌的合適輔助劑。化學藥物治療可提高治療效果，以氟尿嘧啶為基礎用藥。

發明內容

鑒于此，本發明提出一種紫點海葵酶解多肽的制備方法及其應用，本發明制得紫點海葵多肽具有高效抗腫瘤活性。

本發明的技術方案是這樣實現的：

一種紫點海葵酶解多肽的制備方法，包括以下步驟：

S1、預處理：收集紫點海葵，洗凈后剪碎，超聲破碎至溶液渾濁，置于有機溶劑浸泡去脂，沖洗、瀝干，得到紫點海葵樣品；

S2、海葵總蛋白的提取：取步驟S1的紫點海葵樣品，加入混合后的RIPA裂解液與PMSF蛋白酶抑制劑，靜置20-40min后超聲破碎至溶液渾濁；低溫離心，收集上清液得到粗品，真空冷凍干燥，制得海葵蛋白凍干粉；

S3、酶解：取步驟S2的海葵蛋白凍干粉用純水溶解，加入堿性蛋白酶，進行酶解，酶解后煮沸滅活，得到酶解產物經超濾管離心，收集濾液，冷凍干燥，制得紫點海葵多肽。