[發(fā)明專(zhuān)利]一種高靈敏度肌酸激酶同工酶檢測(cè)試劑盒及其制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011373956.8
• 申請(qǐng)日: 2020-11-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112540177A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-03-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄒繼華;田燕丹;劉獻(xiàn)文;方亮
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 美康生物科技股份有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/573
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/573;G01N33/577;G01N33/543
• 代理公司: 寧波甬致專(zhuān)利代理有限公司 33228
• 代理人: 李迎春

本發(fā)明提供了一種高靈敏度肌酸激酶同工酶檢測(cè)試劑盒及其制備方法，包括試劑R1和試劑R2；將抗鼠IgG?Fc抗體與膠乳微球表面氨基反應(yīng)形成shiff堿，使抗鼠IgG?Fc抗體定向標(biāo)記于膠乳微球上，再將抗鼠IgG?Fc抗體與至少兩種鼠抗人CK?MB單克隆抗體連接，使膠乳微球偶聯(lián)上鼠抗人CK?MB單克隆抗體，制得膠乳微球試劑，然后將膠乳微球試劑加入封閉緩沖液重懸超聲后進(jìn)行封閉，再加入膠乳保存液重懸超聲制得膠乳試劑，至少兩種膠乳試劑混合制成試劑R2；與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的試劑盒靈敏度高、檢測(cè)范圍寬、重復(fù)性好、特異性高、穩(wěn)定性好；相較于其他偶聯(lián)方法，本發(fā)明的方法避免了CK?MB單克隆抗體F(ab)端活性位點(diǎn)偶聯(lián)于微球上，同時(shí)增加了CK?MB單克隆抗體偶聯(lián)量，顯著提高了試劑檢測(cè)靈敏度。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)、免疫和體外診斷領(lǐng)域，具體是一種高靈敏度肌酸激酶同工酶檢測(cè)試劑盒及其制備方法。

背景技術(shù)

肌酸激酶(CK)是心肌中重要的能力調(diào)節(jié)酶，主要催化高能磷酸鍵從ATP轉(zhuǎn)移到肌酸，生成磷酸肌酸。磷酸激酶是二聚體酶，主要存在于心肌組織中，在骨骼肌中也有微量分布，其結(jié)構(gòu)由肌型亞單位(M)和腦型亞單位(B)兩個(gè)亞基組成，根據(jù)其亞基組成不同，可分為CK-MM、CK-BB、CK-MB和線(xiàn)粒體肌酸激酶等四種同工酶形式，其中CK-MM主要存在于骨骼肌中，CK-BB主要存在于腦組織中，CK-MB主要存在于心肌組織中。CK-MB分子量為80kD，由M和B兩個(gè)亞單位(每個(gè)亞單位分子量為40kD)組成，在心肌組織中的占CK總量得20％左右，在骨骼肌中也有微量分布，血清中CK-MB含量對(duì)診斷急性心肌梗死、心肌炎等心肌缺血性疾病有重要意義。

CK-MB在心肌損傷早期即可出現(xiàn)于循環(huán)血中，于心肌損傷后2-6h開(kāi)始升高，在12-24h內(nèi)達(dá)到峰值，36-72h內(nèi)降至正常水平，CK-MB含量和時(shí)間變化對(duì)心肌損傷發(fā)病時(shí)間，梗死體積以及再灌注后損傷有重要意義。此外，骨骼肌損傷，橫紋肌溶解癥及中風(fēng)等疾病中也伴隨有CK-MB升高。在心肌損傷相關(guān)疾病診斷上，常與肌紅蛋白和肌鈣蛋白I聯(lián)合檢測(cè)。

目前常規(guī)的CK-MB檢測(cè)主要采用免疫抑制法，檢測(cè)的是CK-MB的活性，其原理是應(yīng)用單克隆抗體與肌酸激酶中的M亞基結(jié)合，抑制CK-MM及CK-MB中的M亞基的活性，再測(cè)定B亞基的活力，將結(jié)果乘以2即為CK-MB的活力，該方法忽略血清中微量的CK-BB，但對(duì)某些惡性腫瘤患者、腦神經(jīng)損傷或平滑肌受損的患者，它們血清中的CK-BB含量會(huì)增高，或出現(xiàn)線(xiàn)粒體CK(CK-Mt)，由于其活性不受抗M抗體的抑制，其B亞基活性與CK-MB中B亞基活性同時(shí)被測(cè)，導(dǎo)致CK-MB檢測(cè)異常增高，易引起AMI的誤診。

酶聯(lián)免疫法(ELISA)是基于雙抗體夾心法檢測(cè)CK-MB，該方法特異性強(qiáng)，但操作繁瑣，自動(dòng)化程度低，耗時(shí)長(zhǎng)。

膠體金免疫層析法，操作簡(jiǎn)便，快速，適合于急診，但其靈敏度低，手工加樣易受操作者影響，常會(huì)出現(xiàn)假陰性。

化學(xué)發(fā)光測(cè)定CK-MB質(zhì)量是美國(guó)心臟病協(xié)會(huì)和歐洲心臟病協(xié)會(huì)推薦的檢驗(yàn)方法，其原理是基于雙抗體夾心法原理的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，將純化的特異性鼠單克隆抗體預(yù)先包被在載體上，加入待測(cè)樣本和酶標(biāo)記的特異性單克隆抗體，形成特異性抗體-抗原-酶標(biāo)記抗體的免疫復(fù)合物，經(jīng)過(guò)激發(fā)后發(fā)出光子，根據(jù)激發(fā)光的大小得出樣本中CK-MB的質(zhì)量數(shù)。該化學(xué)發(fā)光測(cè)定特異性強(qiáng)，精密度高，但成本高，耗時(shí)長(zhǎng)不適用于篩查工作和急診。

膠乳増強(qiáng)免疫比獨(dú)法是一種動(dòng)態(tài)測(cè)定抗原抗體結(jié)合的檢測(cè)方法，在特定的稀釋系統(tǒng)中，抗原抗體發(fā)生結(jié)合，并且在結(jié)合比例合適時(shí)，微粒會(huì)從液相析出；在抗原和抗體結(jié)合的前后，會(huì)發(fā)生濁度的變化；通過(guò)全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)這種濁度變化，并利用標(biāo)準(zhǔn)品繪制線(xiàn)性曲線(xiàn)，可得出相應(yīng)樣品中待測(cè)物質(zhì)的含量。CN111562372A公開(kāi)了基于膠乳增強(qiáng)免疫比濁法的肌酸激酶同工酶MB檢測(cè)試劑盒，但其存在分析靈敏度達(dá)不到臨床要求的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容