[發明專利]一種利用苧麻BnXTH2基因提高辣椒抗寒能力的方法

有效

• 申請號: 202011372775.3
• 申請日: 2020-11-30
• 公開（公告）號: CN112481296B
• 公開（公告）日: 2021-12-21
• 發明（設計）人: 揭雨成;馬玉申;揭紅東;邢虎成;佘瑋
• 申請（專利權）人: 湖南農業大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種利用苧麻BnXTH2基因提高辣椒抗寒能力的方法，其特征在于，所述方法具體為將BnXTH2基因在辣椒中進行過表達，其中，所述BnXTH2基因的完整的開放閱讀框如SEQ IDNO:1所示，編碼氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根據權利要求1所述的利用苧麻BnXTH2基因提高辣椒抗寒能力的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

S1、BnXTH2基因過表達載體的構建；

1.1)提取植物整株的總RNA，反轉錄為cDNA；

1.2)以步驟1.1)得到的cDNA為模板，采用引物BnXTH2-F和BnXTH2-R進行PCR擴增，得到帶酶切位點的BnXTH2的開放閱讀框；

BnXTH2-F:CGGGATCCATGAGATCATCATCAAGTAGT；

BnXTH2-R:CGAGCTCCTAGTAGCCAGCGAGGCACT；

1.3)將表達載體pBI 121和BnXTH2片段進行酶切，酶切體系如下：

37℃反應過夜，凝膠電泳膠回收目的PCR片段；

1.4)采用T4連接酶將步驟1.3)中得到的PCR片段與載體片段連接，具體體系如下：

16℃反應過夜，進行大腸桿菌轉化；

1.5)質粒提取：

將步驟1.4)中成功轉化大腸桿菌采用質粒提取試劑盒進行質粒提取；

1.6)轉化EHA105：

利用步驟1.5)提取得到的質粒進行農桿菌EHA105轉化；

S2、對辣椒進行農桿菌侵染轉化：

2.1)接種農桿菌至含30mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的YEP液體培養基中，搖菌至OD＝1.0；

2.2)4℃離心收集菌體，加入1/2MS液體培養基重懸，使其OD＝0.5，得到農桿菌重懸液；

2.3)將辣椒帶柄子葉浸入農桿菌重懸液中20min后，20度下共培養2d轉移至愈傷及分化培養基為：MS+0.6mg/L IAA+5.0mg/L 6-BA+300mg/LTim+100mg/L Kan，每2周更換一次培養基；

2.4)待長出叢生芽后移入芽伸長培養基為：

Ms+0.8mg/L IAA+2.0mg/L6-BA+2.0mg/LGA3 300mg/LTim+300mg/L Kan

2.5)后移入生根培養基1/2MS+0.5mg/LIAA，生根待根長為1cm左右后移入營養土中正常培養收獲辣椒種子。

3.根據權利要求2所述的利用苧麻BnXTH2基因提高辣椒抗寒能力的方法，其特征在于，還包括轉BnXTH2基因辣椒抗寒凍能力鑒別；其中，將野生型與轉BnXTH2基因T3代辣椒種子浸種催芽后播種于營養土中，15℃正常條件下培養到2-3片葉的幼苗期，將幼苗分別在(5±l)℃,(10±l)℃,(15±l)℃下處理,其中，在(15±l)℃下處理作為對照，第5d和第10d分別取樣測定抗壞血酸及MDA含量；

不同低溫處理后第5d測定幼苗的MDA含量低溫處理第5d,轉基因株系在(5±1)℃MDA的含量比非轉基因株系低28.72％；轉基因株系在(5±1)℃抗壞血酸含量的含量比非轉基因株系高58.72％。