[發(fā)明專利]一種牙源性干細胞的培養(yǎng)與外泌體分離方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011371809.7
• 申請日: 2020-11-30
• 公開（公告）號: CN112458045A
• 公開（公告）日: 2021-03-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 于金華;閆朝婷;周洲;吳錦濤;景雙林;閆明;李澤漢
• 申請（專利權(quán)）人: 南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院;江蘇省鹽業(yè)集團有限責任公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 瞿網(wǎng)蘭

一種牙源性干細胞的培養(yǎng)與外泌體分離方法，其特征是包括以下步驟：1）配置外泌體分離用的培養(yǎng)基并在4℃以下保存；2）取傳代至3?7代的DPSC為實驗對象開始進行實驗；3）經(jīng)過24小時培養(yǎng)，收集細胞上清，為最大程度回收，用1?2ml無菌PBS洗培養(yǎng)皿兩遍，PBS沖洗液+細胞上清作為分離外泌體的對象；4）上一步驟收集的液體在4℃溫度下差速離心去除細胞碎片及死細胞，若液體量少凍至?80℃冰箱待液體充足后進行下一步；5）用規(guī)格為0.22μm的濾器去除較大的細胞外囊泡及其他雜質(zhì)；6）用規(guī)格為100KDa超濾管，在4℃，4000*g,30min條件下進行超濾，去除較小的雜質(zhì)并濃縮得到濃縮液；7）將濃縮液加入外泌體提取得到外泌體。本發(fā)明方法簡單，成本低，效果好。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種干細胞培養(yǎng)技術(shù)，尤其是一種牙源性干細胞的在收集用于外泌體分離的培養(yǎng)基的配置與外泌體分離方式，也可適用于其他干細胞的培養(yǎng)與上清外泌體分離，具體來說是一種牙源性干細胞的培養(yǎng)與外泌體分離方法，是一種外泌體提取的培養(yǎng)—無血清培養(yǎng)的補充與分離方式的非經(jīng)典方法的融合創(chuàng)新：差離-過濾-超濾-試劑盒。

背景技術(shù)

眾所周知，根管治療作為口腔科常見操作之一，雖然在解決牙髓炎、根尖周炎、手術(shù)需要及美容牙科需求而保留牙齒的同時，但其最終會導(dǎo)致牙齒成為強度下降、有折裂風險的死髓牙。牙髓再生是解決死髓牙帶來的種種弊端的方法之一，由于多潛能、增殖能力強、并具有抗炎免疫調(diào)節(jié)等功效，干細胞在組織工程和再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊。利用間充質(zhì)干細胞（以下簡稱MSC）可開展多項再生治療及臨床試驗，目前已有學(xué)者通過自體乳牙干細胞移植使死髓年輕恒牙再生出牙髓樣組織，從而牙根繼續(xù)發(fā)育的成功案例報道。但倫理、副作用等問題曾一度打擊干細胞治療的熱度。細胞外囊泡（extracellular vesicle,EV）是旁分泌途徑中重要的組成部分，越來越引起學(xué)者們的關(guān)注。近期研究表明MSC治療炎癥組織損傷相關(guān)疾病功效至少部分來自其分泌物，即EV與母細胞有相似的治療功效。這為無細胞的干細胞治療帶來希望。

外泌體(exosome)作為EV的組成部分也是近年來生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究熱點之一，它是一群20-200nm大小的細胞外囊泡，分布在各種體液及細胞、細菌等的培養(yǎng)液中，在細胞間通信、物質(zhì)交換方面起重要作用。經(jīng)過學(xué)者們的多年努力，已經(jīng)驗證其在多種疾病診斷、組織損傷修復(fù)、再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、制藥等方面發(fā)揮重要作用。由于其免疫學(xué)特性加以組織工程技術(shù)改造，外泌體可以提供療效更好副作用更小的無細胞干細胞治療。

血清是細胞培養(yǎng)的常用品，富含各種生長因子，也含有會對實驗造成干擾的外泌體。解決方案是使用無外泌體血清或不用血清。無外泌體血清價格相對較高，自制需要超速離心約7小時，由于超速離心機的昂貴與不普及，同一臺機器離心不同樣品增加血清污染的機會，無血清培養(yǎng)即細胞處于饑餓狀態(tài)不利于外泌體的產(chǎn)出，因此，本發(fā)明本著不干擾實驗的前提使用BSA作為替代品，增加細胞“養(yǎng)料”，達到事半功倍的效果。

提取是研究的前提，目前報道的幾種外泌體提取方法仍有不盡人意之處。最經(jīng)典的分離方式是差速超速離心法。一般的流程可以看作兩步：差速離心去除細胞碎片，超高速離心完成分離，大概需要花費4小時左右，如果制備無外泌體血清則需要大約7個小時（實際操作中甚至過夜），需要使用超速離心機和特定的離心管，主要依賴進口，操作復(fù)雜設(shè)備昂貴，相對危險，有些學(xué)者使用超速離心+蔗糖墊即密度-梯度離心法，可獲得稍純的外泌體，但工藝更加復(fù)雜。免疫親和捕獲法（免疫磁珠技術(shù)）通過特定蛋白吸附所以特異性好、耗材昂貴且保存條件苛刻，不適合大量樣本；微流控技術(shù)是基于物理和生物化學(xué)性質(zhì)捕獲微流體中的外泌體，但市面上缺乏成熟的系統(tǒng)；超濾法先去除大顆粒再以小孔徑超濾膜截留外泌體，是比較簡便快捷的方法，適合大量分離，缺點是由于超濾膜易堵造成附著膜上的EV損失；商業(yè)化外泌體分離試劑盒一般利用聚合沉淀的原理分離外泌體，操作簡便，缺點是容易有雜質(zhì)，尤其是進口試劑盒價格相對較高，本實驗使用的是國產(chǎn)Exoperfect試劑盒，文獻報道較常用的Exoquick試劑盒（進口）少。即便大多數(shù)外泌體相關(guān)研究使用的是有雜蛋白污染的外泌體，在進行相關(guān)驗證時仍可以得到滿意的結(jié)果，并在組織再生、疾病診斷、腫瘤的進展與耐藥機制等方面取得一些可喜的研究成果。