[發明專利]一種牙源性干細胞的培養與外泌體分離方法

在審

• 申請號: 202011371809.7
• 申請日: 2020-11-30
• 公開（公告）號: CN112458045A
• 公開（公告）日: 2021-03-09
• 發明（設計）人: 于金華;閆朝婷;周洲;吳錦濤;景雙林;閆明;李澤漢
• 申請（專利權）人: 南京醫科大學附屬口腔醫院;江蘇省鹽業集團有限責任公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 瞿網蘭

1.一種牙源性干細胞的培養與外泌體分離方法，其特征在于它包括以下步驟：

1）配置外泌體分離用的培養基α-MEM+0.5%BSA（牛血清白蛋白）并在4℃以下保存；

2）取傳代至3-7代的DPSC為實驗對象，每大皿培養至細胞匯合度達90%以上約20-100*10⁴個細胞時，開始進行實驗；在收集外泌體至少前一天替換外泌體分離用的培養基；

3）經過24小時培養，收集細胞上清，為最大程度回收，用1-2ml無菌PBS洗培養皿兩遍，PBS沖洗液+細胞上清作為分離外泌體的對象；

4）上一步驟收集的液體在4℃溫度下差速離心3000*g,20min,去除細胞碎片及死細胞，若液體量少凍至-80℃冰箱待液體充足后進行下一步；

5）用規格為0.22μm的濾器去除較大的細胞外囊泡及其他雜質；

6）用規格為100KDa超濾管，在4℃，4000*g,30min條件下進行超濾，去除較小的雜質并濃縮得到濃縮液；

7）將濃縮液加入外泌體提取商業化試劑盒，按說明書比例加入，4℃過夜，差速離心后的沉淀即外泌體，根據沉淀的量用無菌PBS重懸，測蛋白濃度，近一周不使用-80℃儲存，反之則4℃儲存。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟1）中培養基配置需按重量計，試管和封口膜重量要計算，使用規格為0.22μm的濾器進行除菌，不需要額外加抗生素，使用渦旋振蕩器混勻。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟2）和3)將常用培養基換成外泌體分離用培養基的時間是分離前一天即經過24小時進行分離，最長不超72小時。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟4）所述的的液體量少是指小于120ml。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟6）超濾管的消毒使用75%酒精浸泡，無菌水或無菌PBS沖洗并將內管倒置離心1000rpm，5min來沖洗濾孔、濾膜及管壁殘余酒精。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟7）用于外泌體沉淀重懸的PBS選擇20-100μl，或根據實驗需要在濃度測定后適當稀釋。