[發明專利]他克莫司單個核細胞內藥物濃度的檢測方法及應用

在審

• 申請號: 202011371323.3
• 申請日: 2020-11-30
• 公開（公告）號: CN112505183A
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發明（設計）人: 李壹;徐歡;戴鑫華;白楊娟;鄒遠高;張君龍;牛倩;蔡蓓
• 申請（專利權）人: 四川大學華西醫院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 重慶市信立達專利代理事務所(普通合伙) 50230
• 代理人: 陳炳萍

1.他克莫司單個核細胞內藥物濃度的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1：提取單個核細胞

取新鮮EDTA抗凝全血，提取獲得白細胞懸液，每50uL白細胞懸液中的細胞數量為1×10⁶個；

S2：UPLC條件

色譜柱：反相WatersAcquity UPLC BEH C18柱，1.7μm，50mm x 2.1mm，

柱溫：60℃，

流動相：流動相A：為在500mL純水中溶解2mM乙酸銨和0.1％甲酸所得的溶液；流動相B：為在500mL甲醇中溶解2mM乙酸銨和0.1％甲酸所得的溶液；梯度洗脫，流速為0.4mL/min；

S3：MS/MS條件

正離子模式工作，毛細管電壓為1.0kV，源塊溫度為150℃，失溶溫度為350℃，傳輸速度為900L/h；碰撞采用氬氣；

S4：配制標準品

S5：制備標準曲線

S6：檢測單個核細胞內他克莫司的濃度

在裝有50uL步驟S1中的細胞懸液的EP管中加入30uL Lysis Buffer for wholeblood，漩渦混勻，孵育1min使血細胞完全溶解；加20uL內標、40uL MagSiMUS-TDMprep TypeI Particle Mix和145uL OPR Ⅵ，漩渦混勻后，室溫放置2min，在12000rpm的條件下離心5min，取濾液；將200uL濾液轉移至自動進樣瓶中，將10uL體積注射至LC-MS/MS系統中，根據擬合的標準曲線，得到樣品中的濃度，將該濃度乘以50倍，計算出在一個50uL的體系中含有100萬個PBMCs的他克莫司含量。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，UPLC的初始條件為：45％流動相A和55％流動相B，平衡10min；樣品運行條件：流動相B在0.6min時增加至70％，然后在0.7min時迅速變化至90％，然后在0.8min時增加至100％，最終流動相A與流動相B的比例為45:55，即在初始條件下平衡2.2min，總運行時間為3min。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，MS/MS條件中的碰撞槽壓力為3.4×10^-3mbar。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，MS/MS條件中每次過渡的停留時間為50ms；通過多反應監測(MRM)進行數據采集；以在甲醇中混合1ug/mL Tac和Tac¹³C-²H₄注射實驗獲得最佳設置。

5.權利要求1-4中任意一項所述的方法在腎移植術后管理產品中的應用。

6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述產品為腎移植術后TAC治療藥物效果監測裝置或系統。