[發明專利]他克莫司單個核細胞內藥物濃度的檢測方法及應用

在審

• 申請號: 202011371323.3
• 申請日: 2020-11-30
• 公開（公告）號: CN112505183A
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發明（設計）人: 李壹;徐歡;戴鑫華;白楊娟;鄒遠高;張君龍;牛倩;蔡蓓
• 申請（專利權）人: 四川大學華西醫院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 重慶市信立達專利代理事務所(普通合伙) 50230
• 代理人: 陳炳萍

本發明涉及生物醫學領域，公開了他克莫司單個核細胞內藥物濃度的檢測方法，包括提取單個核細胞、UPLC條件、MS/MS條件、配制標準品、制備標準曲線和檢測單個核細胞內他克莫司的濃度；本發明還提供了上述方法在腎移植術后管理產品中的應用。本發明實現了對外周血單個核細胞TAC濃度的檢測，相比全血谷濃度檢測，本發明的檢測方向和方法能夠更加準確真實的反映腎移植受者體內TAC治療藥物的效果，且檢測方法簡單、檢測快速、可實現自動化，檢測結果更加準確。

技術領域

本發明涉及生物醫學領域，具體涉及他克莫司單個核細胞內藥物濃度的檢測方法及應用。

背景技術

他克莫司(Tacrolimus，TAC，又名FK506，商品名普樂可復)治療藥物的濃度監測已經成為腎移植術后常規開展的檢測項目，目前臨床主要采用全血谷濃度(whole bloodtough concentration，C0)檢測進行TAC的治療監測。TAC濃度檢測的方法主要包括免疫學方法和色譜學方法。免疫學方法基于抗藥物特異性單克隆抗體建立，其缺點是不能區分樣本中的藥物和藥物的代謝產物，進而導致其檢測結果不能真實反映體內具有藥理活性的藥物成分，另外由于不同廠家使用的抗體效價和特異性存在差異，導致不同品牌的試劑和不同檢測平臺獲得的TAC濃度檢測結果存在一定差異。色譜學方法雖然能準確識別藥物及其代謝產物、檢測準確度更高，但其樣本前處理步驟復雜、耗時長，不利于常規實驗室開展。目前經常出現部分移植受者即使全血TAC谷濃度符合推薦的參考范圍，但依舊發生了排斥反應或出現感染等不良反應，上述情況提示：現在普遍采用的全血TAC谷濃度檢測不是反映TAC藥物免疫抑制治療效果的最佳指標。

在外周血中，TAC主要分布在紅細胞(占全血濃度的90％左右)和血漿中，淋巴細胞中的TAC僅占全血濃度的約1％，但是TAC卻主要在淋巴細胞內發揮免疫抑制作用，因而全血TAC濃度就不能準確的反映受者淋巴細胞內藥物濃度水平，故而無法準確了解藥物對淋巴細胞的免疫抑制作用和臨床治療效果。由于淋巴細胞是免疫抑制劑發揮藥理效應的靶細胞，TAC的免疫抑制效能與免疫細胞內TAC濃度具有最直接和緊密的聯系，因而對外周血單個核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC)TAC濃度檢測才應該是能夠更加準確真實反映體內TAC治療藥物效果的新監測指標。因此，發明人發明了他克莫司單個核細胞內藥物濃度的檢測方法及應用。

發明內容

基于以上問題，本發明提供他克莫司單個核細胞內藥物濃度的檢測方法及應用，本發明為TAC治療藥物濃度監測提供了新的方向和方法。

為解決以上技術問題，本發明提供了他克莫司單個核細胞內藥物濃度的檢測方法，包括如下步驟：

S1：提取單個核細胞

取新鮮EDTA抗凝全血，提取獲得白細胞懸液，每50uL白細胞懸液中的細胞數量為1×10⁶個；

S2：UPLC條件

色譜柱：反相Waters Acquity UPLC BEH C18柱，1.7μm，50mm x 2.1mm，

柱溫：60℃，

流動相：流動相A：為在500mL純水中溶解2mM乙酸銨和0.1％甲酸所得的溶液；流動相B：為在500mL甲醇中溶解2mM乙酸銨和0.1％甲酸所得的溶液；梯度洗脫，流速為0.4mL/min；

S3：MS/MS條件

正離子模式工作，毛細管電壓為1.0kV，源塊溫度為150℃，失溶溫度為350℃，傳輸速度為900L/h；碰撞采用氬氣；

S4：配制標準品

S5：制備標準曲線

S6：檢測單個核細胞內他克莫司的濃度