[發(fā)明專利]檢測平均單個CAR-T細胞中CAR基因拷貝數(shù)的引物組、熒光探針組、試劑盒及方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202011370271.8 | 申請日： | 2020-11-30 |
| 公開（公告）號： | CN112481361A | 公開（公告）日： | 2021-03-12 |
| 發(fā)明（設計）人： | 焦順昌;張嶸;梁皓;王雪薇 | 申請（專利權(quán)）人： | 北京鼎成肽源生物技術(shù)有限公司 |
| 主分類號： | C12Q1/6851 | 分類號： | C12Q1/6851;C12Q1/6876;C12N15/11 |
| 代理公司： | 北京高沃律師事務所 11569 | 代理人： | 董大媛 |
| 地址： | 102200 北京市昌平區(qū)雙*** | 國省代碼： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 檢測 平均 單個 car 細胞 基因 拷貝 引物 熒光 探針 試劑盒 方法 | ||
本發(fā)明提供了一種檢測平均單個CAR?T細胞中CAR基因拷貝數(shù)的引物組、熒光探針組、試劑盒及方法，屬于生物技術(shù)領域，所述引物組，包括檢測CAR基因的引物對和內(nèi)參基因的引物對；所述熒光探針組，包括檢測CAR基因的熒光探針和檢測內(nèi)參基因的熒光探針；所述試劑盒包括上述引物組和熒光探針組；所述引物的擴增峰單一，特異性好、利用本發(fā)明所述引物組、熒光探針組以及檢測方法獲得的擴增曲線的精確范圍在5～5×106拷貝之間，理論上平均單個CAR?T細胞中CAR基因拷貝數(shù)檢測范圍為可達到10?6～106，結(jié)果精確，檢測范圍廣；具有良好的應用前景。
技術(shù)領域
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領域，尤其涉及一種檢測平均單個CAR-T細胞中CAR基因拷貝數(shù)的引物組、熒光探針組、試劑盒及方法。
背景技術(shù)
CAR-T細胞是通過以下基因工程手段獲得：把識別腫瘤相關(guān)抗原的抗體的單鏈可變區(qū)(Single chainfragment variable，scFv)和T細胞活化序列的融合蛋白表達到T細胞表面，使可以特異識別腫瘤相關(guān)抗原的scFv通過跨膜區(qū)與T細胞胞內(nèi)的活化增殖信號域偶聯(lián)。表達CAR的T細胞以抗原依賴、但非MHC限制的方式結(jié)合腫瘤抗原，啟動并活化特異性殺傷腫瘤反應。
用于臨床治療的CAR-T細胞的制備及質(zhì)控工藝對于CAR-T細胞的療效至關(guān)重要。靈敏精準的CAR基因拷貝數(shù)檢測方法是CAR-T細胞放行及臨床監(jiān)測CAR-T細胞所必需的。雙重熒光定量PCR檢測基因拷貝數(shù)的方法即在DNA擴增反應體系中，兩個基因的擴增產(chǎn)物分別帶有兩種不同的熒光基團，通過對兩種熒光信號的積累統(tǒng)計，同時實時監(jiān)測體系中的兩個基因的產(chǎn)物表達量，進而計算目標基因的拷貝數(shù)。相較于目前較多應用的單基因檢測體系，雙重熒光定量PCR具有靈敏性高，操作簡單等優(yōu)點。
利用雙重熒光定量PCR檢測平均單個CAR-T細胞中CAR基因拷貝數(shù)是一種較優(yōu)的選擇，但是目前的方法還存在特異性差、檢測范圍窄的問題。
發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測平均單個CAR-T細胞中CAR基因拷貝數(shù)的引物組、熒光探針組、試劑盒及方法；所述引物的擴增峰單一，特異性好、利用本發(fā)明所述引物組、熒光探針組以及檢測方法獲得的擴增曲線的精確范圍在5～5×106拷貝之間，理論上平均單個CAR-T細胞中CAR基因拷貝數(shù)檢測范圍為可達到10-6～106，結(jié)果精確，檢測范圍廣。
為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：
本發(fā)明提供了一種檢測平均單個CAR-T細胞中CAR基因拷貝數(shù)的引物組，包括檢測CAR基因的引物對和內(nèi)參基因的引物對；
所述CAR基因包括CD3zeta基因和/或WPRE基因，所述內(nèi)參基因包括ABL基因和/或IFNG基因；
檢測CD3zeta基因的引物對的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；
檢測WPRE基因的引物對的核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；
檢測ABL基因的引物對的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示；
檢測IFNG基因的引物對的核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示。
本發(fā)明提供了一種檢測平均單個CAR-T細胞中CAR基因拷貝數(shù)的熒光探針組，包括檢測CAR基因的熒光探針和檢測內(nèi)參基因的熒光探針；所述CAR基因包括CD3zeta基因和/或WPRE基因，所述內(nèi)參基因包括ABL基因和/或IFNG基因；
檢測CD3zeta基因的熒光探針的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；
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