[發明專利]檢測平均單個CAR-T細胞中CAR基因拷貝數的引物組、熒光探針組、試劑盒及方法

在審

• 申請號: 202011370271.8
• 申請日: 2020-11-30
• 公開（公告）號: CN112481361A
• 公開（公告）日: 2021-03-12
• 發明（設計）人: 焦順昌;張嶸;梁皓;王雪薇
• 申請（專利權）人: 北京鼎成肽源生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/6876;C12N15/11
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 董大媛

1.一種檢測平均單個CAR-T細胞中CAR基因拷貝數的引物組，其特征在于，包括檢測CAR基因的引物對和內參基因的引物對；

所述CAR基因包括CD3zeta基因和/或WPRE基因，所述內參基因包括ABL基因和/或IFNG基因；

檢測CD3zeta基因的引物對的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；

檢測WPRE基因的引物對的核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；

檢測ABL基因的引物對的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示；

檢測IFNG基因的引物對的核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示。

2.一種檢測平均單個CAR-T細胞中CAR基因拷貝數的熒光探針組，其特征在于，包括檢測CAR基因的熒光探針和檢測內參基因的熒光探針；所述CAR基因包括CD3zeta基因和/或WPRE基因，所述內參基因包括ABL基因和/或IFNG基因；

檢測CD3zeta基因的熒光探針的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；

檢測WPRE基因的熒光探針的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；

檢測ABL基因的熒光探針的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示；

檢測IFNG基因的熒光探針的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示。

3.一種檢測平均單個CAR-T細胞中CAR基因拷貝數的試劑盒，其特征在于，包括權利要求1所述的引物組和權利要求2所述的熒光探針組。

4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，包括檢測CD3zeta基因的引物對、檢測IFNG基因的引物對、檢測CD3zeta基因的熒光探針和檢測IFNG基因的熒光探針。

5.根據權利要求3或4所述的試劑盒，其特征在于，還包括雙重熒光定量PCR反應試劑。

6.一種檢測平均單個CAR-T細胞中CAR基因拷貝數的方法，包括以下步驟：

1)將CAR基因和內參基因共同構建到質粒載體上獲得標準質粒；并設置不同濃度的標準質粒；

2)提取待測樣本的全基因組DNA，并將所述全基因組DNA調整到1ng/μl～500ng/μl；

3)將步驟2)中所述的待檢測DNA、CAR基因的引物組、內參基因的引物組、CAR基因的熒光探針、內參基因的熒光探針和雙重熒光定量PCR反應試劑混合獲得待測樣品雙重熒光定量PCR反應體系；

分別將不同濃度的標準質粒與CAR基因的引物組、內參基因的引物組、CAR基因的熒光探針、內參基因的熒光探針和雙重熒光定量PCR反應試劑混合獲得不同濃度的標準質粒雙重熒光定量PCR反應體系；

將所述待測樣品雙重熒光定量PCR反應體系、不同濃度的標準質粒雙重熒光定量PCR反應體系上機進行熒光定量PCR檢測，獲得待測樣品CAR基因的Ct值、待測樣品內參基因的Ct值、不同濃度的標準質粒CAR基因的Ct值和不同濃度的標準質粒內參基因的Ct值；

計算待測樣品CAR-T細胞中CAR基因拷貝數；

待測樣品CAR-T細胞中CAR基因拷貝數＝2^-△△Ct×2；

其中△△Ct＝待測樣品的△Ct-矯正系數；

待測樣品的△Ct＝待測樣品的CAR基因Ct值-待測樣品的內參基因的Ct值；

矯正系數＝(△Ct1+△Ct2……△Ctn)/n；

其中△Ctn＝標準質粒CAR基因的Ctn值-標準質粒內參基因的Ctn值，n為某一特定濃度。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述不同濃度的標準質粒的濃度為1.25copies/μl～1.25×10⁶copies/μl。

8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述待測樣品雙重熒光定量PCR反應體系以20μl計，包括以下組分：

標準質粒雙重熒光定量PCR反應體系以20μl計，包括以下組分：