[發明專利]LAMP等溫擴增試劑的凍干微球及其制備方法以及應用

有效

• 申請號: 202011369841.1
• 申請日: 2020-11-30
• 公開（公告）號: CN112481359B
• 公開（公告）日: 2021-09-17
• 發明（設計）人: 王云龍;王群智;邵俊影;王欣;林圣博;李強;王麗;王雯麗;王昱堃
• 申請（專利權）人: 河南智泰生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844
• 代理公司: 鄭州先風知識產權代理有限公司 41127
• 代理人: 張鵬輝

本發明涉及一種LAMP等溫擴增試劑的凍干微球及其制備方法以及應用，該LAMP等溫擴增試劑的凍干微球，包括LAMP引物組、凍干保護劑以及反應液；所述LAMP引物組包括外引物F3、外引物B3、內引物FIP、內引物BIP、環引物LF、環引物LB；所述凍干保護劑包括牛血清蛋白、蘇氨酸和PEG20000；LAMP引物組、凍干保護劑、反應液的添加的體積份數分別為：7～14份、9～17份、9.2～17.75份。LAMP等溫擴增試劑的凍干微球可增加檢測試劑的穩定性，可常溫運輸，節約能源和運輸成本，且便于分裝。

技術領域

本發明屬于核酸檢測技術領域，具體涉及一種LAMP等溫擴增試劑的凍干微球及其制備方法以及應用。

背景技術

環介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是日本榮研株式會發明的一種核酸體外擴增技術，根據靶標基因的6個區域，設計4條特異性引物，利用Bst DNA Polymerase的鏈置換作用可以在60～65℃條件下，1小時內完成10⁹～10¹⁰倍的擴增。由于LAMP擴增過程依賴識別靶序列6個獨立區域，所以反應特異性很強，并且核酸擴增過程是在恒溫條件下進行，普通水浴鍋或者有穩定熱源的設備就能滿足反應要求。相對于普通PCR技術，LAMP技術具有操作簡單、檢測快速、特異性高、成本低等優點。

目前，LAMP已成功應用于多個領域的檢測，特別是應用于生物病原菌的檢測，例如非洲豬瘟病毒、結核桿菌、2019-nCOV等，并得到WHO的認可及大力推廣。但是，由于LAMP反應所需要的Bst DNA Polymerase、dNTP和引物等成分需要在低溫條件下運輸保存，成本較高；且非全體系凍干情況下需要實驗人員自己配置反應體系，容易出現誤差及錯誤，操作繁瑣，同時對實驗人員具有較高的要求。同時，LAMP技術的氣溶膠污染容易造成假陽性結果也進一步增加了該技術的應用及推廣難度。

冷凍干燥技術又稱升華干燥，是一種將含水物料在冰點以下和較高真空條件下直接去除水分的干燥方法。可以避免熱敏性物質發生生物、化學或物理變化，并最大限度保持原料的活性和物理、化學性質。

申請公布號為CN109486907A的發明專利公開了一種可常溫運輸的環介導等溫擴增試劑、制備方法及應用，該環介導等溫擴增試劑包括Bst DNA Polymerase、dNTP、引物混合物、指示劑、保護劑和氣溶膠污染預防劑；所述的引物混合物中包含引物FIP、BIP、LF、LB、F3和B3；所述的指示劑中包含HNB溶液和Gelgreen溶液；所述的保護劑中包含牛血清白蛋白、大豆卵磷脂、甘露醇和羥乙基淀粉；所述的氣溶膠污染預防劑中包含甘草甜素、海藻酸鈉和叔丁醇，制備方法為：將Bst DNA Polymerase、dNTP、引物混合物、指示劑、保護劑和氣溶膠污染預防劑按照比例混合，在-70℃～-80℃下冷凍干燥8～16h，即得。上述制備方法得到環介導等溫擴增試劑是粉狀的，凍干粉試劑不易定量，不易分裝，無法滿足即時檢測類產品的需求。

發明內容

本發明的第一個目的是提供一種LAMP等溫擴增試劑的凍干微球，該LAMP等溫擴增試劑的凍干微球，可增加檢測試劑的穩定性，可常溫運輸，節約能源和運輸成本，且便于分裝。

本發明的第二個目的是提供一種LAMP等溫擴增試劑的凍干微球的制備方法。

本發明的第三個目的是提供一種LAMP等溫擴增試劑的凍干微球的應用。

為了實現以上目的，本發明采取的技術方案為：

LAMP等溫擴增試劑的凍干微球，包括LAMP引物組、凍干保護劑以及反應液；

所述LAMP引物組包括外引物F3、外引物B3、內引物FIP、內引物BIP、環引物LF、環引物LB；

所述凍干保護劑包括牛血清蛋白、蘇氨酸和PEG20000；