[發明專利]一種皮下注射人免疫球蛋白的制備方法

有效

• 申請號: 202011369121.5
• 申請日: 2020-11-30
• 公開（公告）號: CN112375141B
• 公開（公告）日: 2022-07-19
• 發明（設計）人: 蘭學淵;張庭喜;蔣炳姣;孔維權;呂紹玉;李秋;屈信顏;孫文
• 申請（專利權）人: 廣西冠峰生物制品有限公司
• 主分類號: C07K16/06
• 分類號: C07K16/06;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30;C07K1/18
• 代理公司: 南寧東之智專利代理有限公司 45128
• 代理人: 杜啟杰;汪治興

1.一種皮下注射人免疫球蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）FII+III/FI+II+III分離：在FI上清液或血漿中添加pH4.0醋酸鹽緩沖液，將pH調節至5.8～6.2；再加入溫度在-15℃以下、體積分數為95%的乙醇至乙醇的體積達混合液體積的18～22%，同時將混合液溫度降至-6～-4℃，沉淀老化，得到第一靜置液；在-6～-4℃條件下離心所述的第一靜置液，得到離心分離的沉淀；離心工藝參數為：離心機轉速為15000rpm；

（2）FIII/FI+III分離：用10～15倍0～5℃的注射用水溶解所述的離心分離的沉淀，再加入磷酸鹽緩沖液調節pH至4.6～4.9，反應1小時后，用磷酸鹽緩沖液調節pH至5.0～5.4，反應1小時后，用0～5℃注射用水調節電導率至0.6～1.6ms/cm，加入溫度在-15℃以下、體積分數為95%的乙醇至乙醇的體積達混合液體積的10～12%，同時將混合液溫度降低至-5～-3℃沉淀，得到沉淀的混合液；在-5～-3℃條件下離心分離沉淀的混合液，收集FIII/FI+III上清液；離心工藝參數為：離心機轉速為15000rpm；

（3）澄清過濾：按6～10g/L的比例在所述的FIII/FI+III上清液中添加助濾劑，用去脂濾板進行深層過濾，過濾壓力不超過0.3Mpa，得到濾板過濾的澄清濾液；

（4）超濾濃縮透析：用50KD超濾膜將所述的濾板過濾的澄清濾液濃縮至蛋白質含量為4.5～5.5%，得到濃縮澄清濾液；用不低于濃縮澄清濾液5倍體積的0～24℃注射用水透析所述的濃縮澄清濾液，跨膜壓力為0.1～0.3Mpa，得到透析濃縮液；

（5）S/D病毒滅活：在所述的透析濃縮液中添加吐溫80至吐溫80的質量分數為0.9～1.1%，再加入磷酸三丁酯至磷酸三丁酯的質量分數為0.28～0.32%，于25±1℃條件下，S/D病毒滅活6h以上，得到滅活的透析濃縮液；

（6）PEG沉淀：將所述的滅活的透析濃縮液的稀釋至蛋白質的質量分數為1.8～2.2%，并將pH調節至6.5～7.5，添加PEG4000至PEG4000的質量分數為10～16%，得到PEG沉淀反應物；

（7）離心分離：將所述的PEG沉淀反應物離心，得到PEG離心的沉淀；

（8）沉淀溶解和過濾：用PEG離心的沉淀4-6倍體積的2～8℃注射用水溶解PEG離心的沉淀，用深層濾板過濾，得到PEG沉淀澄清過濾液；

（9）第一步陰離子交換層析：將所述的PEG沉淀澄清過濾液的pH調節至5.0～5.4，用5CV、20～40mM、pH為5.0～5.4的醋酸鹽緩沖液平衡層析柱，以100～400cm/h線性流速上樣，收集280nm紫外吸收峰流穿液用于進一步層析純化；

（10）第二步陰離子交換層析：用1mol/LNaOH將所述的流穿液的pH調節至6.5～7.5，用氯化鈉調節流穿液的電導率至3.5～5.5ms/cm，用5CV、25～45mM、pH為6.5~7.5的醋酸鹽平衡液平衡層析柱，以100～400cm/h線性流速上樣，收集280nm紫外吸收峰流穿液用于進一步處理；

（11）去脂過濾：用0.5MHCL將步驟（10）收集得到的流穿液的pH調節至3.8～4.4，并用去脂濾芯過濾，壓力不超過0.3Mpa，得到過濾的澄清液；

（12）超濾配制：用50KD超濾膜濃縮所述過濾的澄清液，得到濃縮液；用0～24℃注射用水透析所述的濃縮液，注射用水的使用量不低于所述濃縮液的8倍體積，透析后將制品濃縮配制成蛋白質的質量分數為5%、pH為3.8～4.4的原液；

（13）低pH病毒滅活：將經除菌過濾后原液，在24℃條件下連續孵放21天以上，滅活殘留的脂包膜病毒，得到病毒滅活原液；

（14）納米膜除病毒過濾：用20納米的納米膜對所述的病毒滅活原液進行除病毒過濾，得到除病毒過濾原液；

（15）濃縮配制：用100Kd超濾膜濃縮所述的除病毒過濾原液，得到濃縮的原液；按200g/L蛋白質含量進行配制，添加甘氨酸至甘氨酸的濃度為0.2～0.4mol/L，pH為3.8～4.4，即得所述的皮下注射人免疫球蛋白。

2.根據權利要求1所述的一種皮下注射人免疫球蛋白的制備方法，其特征在于，所述步驟（3）中的助濾劑是珍珠巖。