[發明專利]一種抗濃核病家蠶的選育方法

有效

• 申請號: 202011367023.8
• 申請日: 2020-11-27
• 公開（公告）號: CN112369376B
• 公開（公告）日: 2022-04-26
• 發明（設計）人: 高亦涵;龐慧琳;王學楊;孫霞;秦笙;李木旺
• 申請（專利權）人: 江蘇科技大學
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 冒艷

本發明公開了一種抗濃核病家蠶的選育方法，F1代：確定Bmnsd?Z靶點并構建含sgRNA質粒pXL[IE1?DsRed?U6?sgRNA]，導入家蠶體內；F2代：將帶有質粒F1代自交，篩選紅色熒光個體，獲得F2代陽性個體；F3代：F2代與表達Cas9蛋白品系家蠶雜交得到雙熒光后代，通過對濃核病抗病能力以及基因組鑒定進行初篩選，確定F3代陽性個體；F4代：F3代自交篩選無熒光個體并再次進行基因組和抗病能力的鑒定，確定具有抗濃核病能力無熒光的目標品系；F5代：F4代中選出的目標品系與Js品種進行雜交，將抗性基因導入受體品種中培育。培育得到對濃核病具有抗性且可以用于生產的家蠶。

技術領域

本發明涉及家蠶抗病品系品種選育，特別涉及一種抗濃核病家蠶的選育方法。

背景技術

家蠶是一種具有代表性的鱗翅目昆蟲，被廣泛用作研究生物學模型。在傳統的絲綢紡織業中，家蠶擁有產絲優質，生命周期短，易繁殖等特點。蠶桑目前仍是許多農村地區的支柱產業之一，但由于蠶病嚴重威脅蠶業生產，每年都會造成的占蠶業總產量的20％經濟損失，其中包括細菌、真菌、和病毒病，濃核病便是其中之一。

濃核病是近年來影響蠶桑生產的主要病害之一，家蠶經口感染濃核病后潛伏期通常在7天左右，主要病癥是染病蠶體肌肉松弛，發育較為緩慢且體型瘦小，餉食后幾乎不生長，蠶體差異大小顯著。主要表現為空頭，染病重的家蠶不食用桑葉，爬向蠶座四周，頭胸部向后傾倒，消化道內幾乎沒有桑葉碎片，只有半透明的消化液，直至死亡。

多年研究表明，不同的家蠶品系對濃核病的抗病能力差異顯著，關于家蠶抗濃核病能力的研究主要集中在抗病基因以及抗病機制分子水平的研究上-用存活率的高低或者生長發育大小來評價，適合大量基礎性研究，不涉及家蠶的繭絲產量以及經濟性狀的問題。但是在實際生產中，家蠶繭絲量的多少才是至關重要的。繭絲是蠶桑行業產量和質量效益的主要決定因素，因此培育具有抗性且繭絲性狀良好的品種對于穩定生產具有重要作用。另外，傳統常規性育種方法可以有效的抵制病毒對家蠶的傷害，但由于傳統方法成效緩慢，培育周期較長，工作量極大限制了其育種的效率，基因編輯技術則是目前更為快速的抗病技術。

發明內容

發明目的：本發明目的是提供一種抗濃核病家蠶的選育方法。該方法通過基因編輯的技術改變家蠶體內抗病機制，明確各代性狀篩選標準，以選育出在綜合性狀方面既具有高抗病力又經濟性狀良好的家蠶品種。具體是利用CRISPR/Cas9技術敲除靶標基因獲得基因突變體，從而培育出新的抗病突變品系。

技術方案：本發明提供一種抗濃核病家蠶的選育方法，包括如下步驟：

(1)F1代：確定Bmnsd-Z靶點并且構建質粒pXL[IE1-DsRed-U6-Bmnsd-Z-sgRNA]，圖譜見圖2，利用基因編輯技術通過顯微注射技術將構建好的質粒導入家蠶體內得到注射品系；

(2)F2代：將帶有sgRNA的紅色熒光F1代進行自交，篩選紅色熒光個體，獲得F2代陽性個體；

(3)F3代：F2代與轉基因Cas9品系雜交得到的家蠶通過熒光篩選以及基因組的鑒定進行對濃核病抗病能力的初篩選，得到抗病初品系；

(4)F4代：將F3代中對濃核病具有抵抗能力的家蠶進行自交，篩選沒有熒光的個體并再次進行基因組以及抗病能力的鑒定，確定具有抗濃核病能力無熒光的目標品系；

(5)F5代：對F4代中選出的目標品系與家蠶品種進行雜交，將抗性基因導入受體品種中，育成對濃核病具有高抵抗性的家蠶新品系并組配成新品種。

進一步地，根據數據庫，查找基因的CDS序列和基因組序列，比對各個基因CDS序列和基因組序列，分析出內含子與外顯子部分，再根據CRISPR/Cas9靶點的設計5’-GGNN18NGG-3’，利用軟件對Bmnsd-Z基因的ORF區域進行特異性靶點的設計；