[發明專利]一種抗濃核病家蠶的選育方法

有效

• 申請號: 202011367023.8
• 申請日: 2020-11-27
• 公開（公告）號: CN112369376B
• 公開（公告）日: 2022-04-26
• 發明（設計）人: 高亦涵;龐慧琳;王學楊;孫霞;秦笙;李木旺
• 申請（專利權）人: 江蘇科技大學
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 冒艷

1.一種抗濃核病家蠶的選育方法，其特征在于：包括如下步驟：

（1）F1代：確定Bmnsd-Z靶點并且構建質粒pXL-IE1- DsRed -U6-Bmnsd-Z- sgRNA，通過顯微注射技術將構建好的質粒導入家蠶體內得到注射品系；

（2）F2代：將帶有sgRNA質粒的F1代進行自交，篩選紅色熒光個體，獲得F2代陽性個體；

（3）F3代：F2代與表達Cas9蛋白家蠶品系雜交得到的家蠶，通過熒光篩選以及基因組的鑒定同時進行濃核病抗病能力的初篩選，確定抗病初品系F3代；

（4）F4代：將F3代中家蠶進行自交，篩選無熒光個體并再次進行基因組以及抗病能力的鑒定，確定具有抗濃核病能力無熒光的目標品系即F4代；

（5）F5代：對F4代中選出的目標品系與家蠶Js品種進行雜交，將抗性基因導入受體品種中，育成對濃核病具有高抵抗性且性狀優良的家蠶新品系并組配成新品種；

步驟（1）的方法如下：根據數據庫，查找基因的CDS序列和基因組序列，比對基因CDS序列和基因組序列，分析出內含子與外顯子部分，再根據CRISPR/Cas9靶點的設計原則5’-NN20NGG-3’，利用軟件對Bmnsd-Z基因的ORF區域進行特異性靶點的設計；

以載體pXL-IE1-DsRed為初始質粒，通過同源重組將特異性sgRNA表達框克隆至初始質粒獲得目的質粒pXL-IE1-DsRed-U6-Bmnsd-Z-sgRNA，

質粒pXL-IE1-DsRed -U6-Bmnsd-Z-sgRNA含有由IE1啟動表達紅色熒光報告基因DsRed蛋白基因，sgRNA由U6啟動子啟動表達，將目的質粒、輔助質粒helper質粒混合起來顯微注射至家蠶胚胎，恒溫培養至成蟲，為F1代。

2.據權利要求1所述的抗濃核病家蠶的選育方法，其特征在于：步驟（3）的中的初篩選標準為：含有紅色、綠色熒光且基因組水平上基因實現了敲除，在自然條件下對0.1%濃度的BmDNV具有抗病能力的個體。

3.據權利要求1所述的抗濃核病家蠶的選育方法，其特征在于：步驟（4）的篩選標準為：基因組水平上基因實現了敲除的個體的無熒光個體，在自然條件下對0.1%濃度的BmDNV具有抗病能力的個體。

4.據權 利要求1所述的抗濃核病家蠶的選育方法，其特征在于：步驟（5）中與Js品種進行雜交，在自然條件下對0.1%濃度的BmDNV具有抗病能力的個體，且繭絲經濟性狀優良的個體。