[發明專利]一種豬丹毒SpaA抗原蛋白及其優化克隆的制備方法

在審

• 申請號: 202011366261.7
• 申請日: 2020-11-29
• 公開（公告）號: CN113388624A
• 公開（公告）日: 2021-09-14
• 發明（設計）人: 陳貴錢;陳劍清;藍勝芝;呂正兵
• 申請（專利權）人: 浙江理工大學
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C07K14/195;C12N15/70;A61K39/02;A61P31/04;C12R1/19
• 代理公司: 上海諾衣知識產權代理事務所(普通合伙) 31298
• 代理人: 衣然

本發明涉及一種豬丹毒SpaA抗原蛋白及其優化克隆的制備方法，所述豬丹毒SpaA抗原蛋白的編碼基因序列如SEQ ID NO.1所示；所述制備方法包括如下步驟：構建含有上述重組蛋白基因的表達載體；重組蛋白的表達。本發明通過分析SpaA蛋白序列，根絕其序列特征進行了剔除和優化；將信號肽等序列刪除，通過兼并密碼子優化獲得克隆序列；并利用大腸桿菌的胞質空間進行克隆和蛋白表達，最后進行純化獲得重組SpaA蛋白；抗原包被后進行畜牧豬丹毒感染的特異性檢測，為后續診斷和治療提供了基礎。

技術領域

本發明涉及疫苗技術領域，尤其是涉及一種豬丹毒SpaA抗原蛋白及其優化克隆的制備方法。

背景技術

豬丹毒桿菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）是一種細長的，多形性，無孢子的革蘭氏陽性桿菌，直徑為0.2-0.4pm，長度為0.8-2.5μm。菌體以單鏈、短鏈、雙鏈呈“V”形或隨機組合排列，有時也會以絲狀體或長鏈排列。豬丹毒桿菌的最佳生長溫度在30-37℃，但它的生長溫度范圍可到5-44℃。其最佳的生長pH值在7.2-7.6，但生長pH值范圍為6.8-8.2，是一種厭氧菌。于1878年由koch首次分離出來。到1886年，Loeffler檢測認定其為豬丹毒疾病的病原體。1909年，Rosenbach又從人類中的局部皮膚病患者身上分離得到這種菌，從而確認了它也是一種人類病原體，因此，豬丹毒桿菌是一類人畜共患類疾病——豬丹毒的病原體。豬丹毒桿菌的主要宿主一般是家豬，但也會感染其他多種鳥類和嚙齒類動物，魚類的感染雖然不會出現明確的已知病癥，但是豬丹毒桿菌能在魚類的體表粘液中長期生存，也就是說魚類能夠長期攜帶豬丹毒桿菌，這大大增加了人類感染豬丹毒桿菌的風險。

近幾年的研究發現，豬丹毒桿菌中存在幾種相對分子質量為64、66、43kDa的表面蛋白具有免疫保護作用，Makino研究組克隆表達出大小為64kDa的表面蛋白，將其命名為表面保護性抗原A，即豬丹毒SpaA蛋白（surface protein A）。多個研究小組對SpaA蛋白進行免疫功能的研究后認定SpaA蛋白具有良好的免疫保護效用。隨后Ho To等又研究發現SpaA蛋白是11種主要血清型的豬丹毒桿菌的共有抗原，這個研究表明了SpaA蛋白廣泛存在于多種豬丹毒桿菌菌株中。Kitajima等從血清型2豬丹毒桿菌Kyoto株種提取抗原SpaA蛋白，然后用血清型1a的強毒株和血清型2的強毒株進行肌肉攻擊，結果表明從血清型2的菌株種提取的SpaA抗原能夠完全保護豬受到同源強毒株或異源強毒株的致死性感染，并且其免疫保護能力強于傳統的弱毒活菌疫苗，這個實驗也一定程度證明了SpaA蛋白具有對多種血清型的豬丹毒桿菌產生免疫原性的潛力，是制備豬丹毒桿菌亞單位疫苗的候選抗原。編碼的SpaA由N端的免疫保護性區域和C端的細胞結合區域組成。重組SpaA可誘導產生較高水平的特異性抗體IgG,使Th1、Th2細胞因子 (TNF-β、IFN-γ、IL-5、IL-10)含量顯著提升。因此，SpaA能共同激發機體的體液免疫和細胞免疫。小鼠保護性試驗及病理組織學觀察研究表明，在存在尿激酶的情況下，豬丹毒桿菌可以結合宿主纖溶酶原并表現出纖溶酶活性，將纖溶酶原系統用于跨組織屏障的遷移或感染期間的營養需求。因此，像其他病原菌一樣，豬丹毒桿菌可在以下四個方面利用纖溶酶原/纖溶酶系統作為毒力因子：靶向宿主纖溶系統和降解纖維蛋白凝塊，產生生物活性裂解片段以影響信號傳導途徑，激活基質金屬蛋白酶以協助降解組織屏障，并破壞免疫效應分子以逃避免疫。因此，纖維蛋白溶酶原的利用可能是在豬丹毒桿菌感染過程中的重要機制。而SpaA可以特異性結合宿主纖溶酶原，因此抗SpaA血清可顯著降低豬丹毒桿菌結合纖溶酶原的活性。其他一些研究又表明SpaA蛋白參與了豬丹毒桿菌宿主細胞的粘附以及對補體介導的殺傷的抑制。綜上所述，SpaA蛋白能有效干預豬丹毒桿菌對宿主的感染，具有良好的免疫保護作用，有成為豬丹毒的新型亞單位疫苗的巨大潛力，基于目前豬丹毒桿菌仍舊無法得到良好有效的控制的情況，這讓SpaA蛋白成為了目前豬丹毒新型疫苗的主要研究方向。目前針對豬丹毒檢測和治理仍然沒有有效的疫苗和診斷試劑盒，主要是由于豬丹毒SpaA序列比較長，因而比較難以獲得有效抗原序列。