[發明專利]一種2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮還原酶重組菌株及構建方法和應用

有效

• 申請號: 202011364791.8
• 申請日: 2020-11-27
• 公開（公告）號: CN112410276B
• 公開（公告）日: 2023-03-21
• 發明（設計）人: 石利平;葉金星;陳本順;何偉;徐春濤;程瑞華;孫偉振;仲召亮;張維冰;何義;尹斌;陸夢云
• 申請（專利權）人: 江蘇阿爾法藥業股份有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/53;C12N15/70;C12N15/66;C12N9/04;C12P7/22;C12R1/19
• 代理公司: 常州佰業騰飛專利代理事務所(普通合伙) 32231
• 代理人: 馬曉敏

本發明涉及基因工程與酶工程技術領域，尤其是一種2?氯?1?(3,4?二氟苯基)乙酮還原酶重組菌株及構建方法和應用，所述重組菌株以pET?30a質粒為載體，表達2?氯?1?(3,4?二氟苯基)乙酮還原酶基因；所述2?氯?1?(3,4?二氟苯基)乙酮還原酶基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本發明在大腸桿菌中實現了重組表達，手性選擇ee值可達100％，可以替代現有的化學法進行(S)?2?氯?1?(3,4?二氟苯基)乙醇的高效清潔生產。

技術領域

本發明涉及基因工程與酶工程技術領域，具體領域為一種2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮還原酶重組菌株的構建及其應用。

背景技術

替格瑞洛是一種由英國的阿斯利康公司所研發的新型的具有選擇性的小分子抗凝血藥，它是屬于環戊基三唑嘧啶類口服抗血小板藥物，是一種選擇性二磷酸腺苷受體拮抗劑，作用于P2Y12ADP受體來抑制ADP介導的血小板活化和聚集，該藥于2011年7月被美國FDA批準上市，2012年11月獲準在中國上市。其中，(1R,2S)-2-(3,4二氟苯基)環丙胺是制備替格瑞洛的關鍵中間體。

目前文獻報道的(1R，2S)-2-(3,4二氟苯基)環丙胺的主要合成方法如下：

WO2008018822A公開了以鄰二氟苯和氯乙酰氯為原料經傅克反應、不對稱還原、環化、環丙烷化，氨解和霍夫曼降解得到(1R，2S)-2-(3,4_二氟苯基)環丙胺，其合成路線如下：

在上述合成路線中，化合物VII制備化合物VI采用化學方法進行不對稱還原，存在手性選擇性差、光學純度差、操作繁瑣、生產成本高且污染嚴重等問題。

CN107686447A和CN106906249A均提及了一種替格瑞洛中間體(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的酶催化制備方法，但酶活較低，有機溶劑使用量大。且CN107686447的酶催化反應需要葡糖的添加，增加了廢水處理量，且真菌發酵產酶的生產成本要高于常規的E.coli菌株。

因此，目前仍亟需一種經濟有效的(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的生物制備方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮還原酶重組菌株及構建方法和應用，通過基因工程技術篩選高效催化2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮還原的還原酶基因并實現異源功能性表達，獲得高效催化2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮生成重要的藥物中間體(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的生物催化劑。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮還原酶重組菌株，以pET-30a質粒為載體，表達2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮還原酶基因；所述2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮還原酶基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。所述2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮還原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

將2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮還原酶基因連接到pET-30a質粒的BamH I和XhoI位點，然后轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中進行表達。

一種2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮還原酶重組菌株的構建方法：