[發(fā)明專利]一種2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮還原酶重組菌株及構(gòu)建方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011364791.8
• 申請日: 2020-11-27
• 公開（公告）號: CN112410276B
• 公開（公告）日: 2023-03-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 石利平;葉金星;陳本順;何偉;徐春濤;程瑞華;孫偉振;仲召亮;張維冰;何義;尹斌;陸夢云
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇阿爾法藥業(yè)股份有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/53;C12N15/70;C12N15/66;C12N9/04;C12P7/22;C12R1/19
• 代理公司: 常州佰業(yè)騰飛專利代理事務(wù)所(普通合伙) 32231
• 代理人: 馬曉敏

1.一種2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮還原酶重組菌株，其特征在于：所述重組菌株以pET-30a質(zhì)粒為載體，表達(dá)2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮還原酶基因；所述2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮還原酶基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮還原酶基因連接到pET-30a質(zhì)粒的BamH I和XhoI位點(diǎn)，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮還原酶重組菌株，其特征在于：所述2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮還原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.權(quán)利要求1或2所述的2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮還原酶重組菌株的構(gòu)建方法，其特征在于：設(shè)計(jì)2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮還原酶基因的上下游引物P1、P2，如SEQ IDNO：3-4所示；將pET-30a質(zhì)粒BamH I和XhoI雙酶切處理后，電泳檢驗(yàn)回收；將目的基因與載體pET-30a連接，連接體系：目的基因4 μL，載體pET-30a 2 μL，Buffer 2 μL，連接酶1 μL，16℃過夜連接；將構(gòu)建好的載體通過轉(zhuǎn)化技術(shù)導(dǎo)入E. coli BL21(DE3)中，涂布在含卡那霉素的LB平板中，放入37 ℃培養(yǎng)箱中過夜，將長出來的單菌落進(jìn)行質(zhì)粒提取和測序，最終獲得含2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮還原酶基因的重組工程菌。

4.采用權(quán)利要求1或2所述的2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮還原酶重組菌株發(fā)酵生產(chǎn)2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮還原酶的方法。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮還原酶的方法，其特征在于：將2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮還原酶重組菌株種子液按照2%的接種量轉(zhuǎn)接于LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600=0.6時(shí)，加入50 μl 0.5 mol/L的IPTG，18 ℃誘導(dǎo)14 h，得到2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮還原酶發(fā)酵液。