[發明專利]一種達比加群中間體的酶催化合成方法及脂肪酶

有效

• 申請號: 202011360171.7
• 申請日: 2020-11-27
• 公開（公告）號: CN112342204B
• 公開（公告）日: 2022-05-31
• 發明（設計）人: 陳本順;李大偉;何偉;石利平;徐春濤;馬驤;錢若燦;許鵬;萬新強;尹斌;王歡;唐旻奕
• 申請（專利權）人: 江蘇阿爾法藥業股份有限公司
• 主分類號: C12N9/20
• 分類號: C12N9/20;C12N15/55;C12N15/70;C12P17/12
• 代理公司: 常州佰業騰飛專利代理事務所(普通合伙) 32231
• 代理人: 張紅艷

本發明涉及酶工程技術領域，尤其是一種達比加群中間體的酶催化合成方法及脂肪酶，該方法化合物II和化合物III為底物，以優化后的CALB為催化劑，生物催化制備化合物I，反應式為本發明方法制備操作簡便，對環境友好，成本低，實現了C?N的酶催化成鍵，具有很好的應用前景。

技術領域

本發明涉及酶工程領域，具體領域為一種達比加群中間體的酶催化合成方法。

背景技術

達比加群酯(Dabigatran etexilate)，商品名泰畢全，CAS號211915-06-9，是新一代口服抗凝血藥物，由德國的勃林格殷格翰制藥公司研制開發。2008年在德國和英國上市，用于關節置換術后靜脈血栓栓塞癥形成的預防。

1998年，達比加群酯化合物的專利WO9837075報道了達比加群酯類似物的合成方法。該方法以對氯間硝基苯甲酸甲酯D1為原料，制備化合物DF，該路線合成D3和DE副反應多，收率較低，成本偏高，對環境的污染較為嚴重。

達比加群酯的化合物專利WO9837075、專利CN10600709、CN1861596等報道了另外一條合成路線，以對氯間硝基苯甲酸DA為原料，通過取代偶聯，氫化還原，再縮合和環化得到關鍵中間體DE。DE后的工藝和第一條路線相同，具體路線如下所示。與路線一相比，合成過程中不需要將4-氯-3-硝基苯甲酸甲酯的甲酯水解，減少反應步驟，提髙工藝總收率。該工藝反應步驟比較短，成本相對較低。

在該路線中，DB制備DC需要重要中間體D1N1，D1N1的合成主要為化學方法制備，需要甲苯等有機溶劑參與，且容易產生三種雜質(如下Z1/Z2/Z3)。

發明內容

本發明的第一目的在于提供一種脂肪酶。

本發明的第二目的在于提供一種上述脂肪酶的制備方法。

本發明的第三目的在于提供一種采用脂肪酶催化合成達比加群中間體的方法。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種脂肪酶，其基因來源菌株為南極假絲酵母，為優化后的CALB(南極假絲酵母脂肪酶B)，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。該脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2 所示。

上述脂肪酶的制備方法：將優化后的CALB的序列經過PCR擴增后，導入質粒pRSFDuet-1的HindⅢ和BamHⅠ酶切位點獲得重組表達載體，將重組表達載體電轉入 CALB表達細胞中，得到CALB表達工程菌，經過抗生素抗性平板涂布篩選后，獲得克隆菌株，送檢測序確認無誤，進行活化后發酵培養，離心收集菌體，洗滌并重懸，超聲破碎，凍干得到CALB凍干粉。

其中，所述CALB表達細胞為E.coli Rosetta(DE3)。

采用上述脂肪酶催化合成達比加群中間體的方法，包括如下步驟：以化合物II為底物，在優化后的CALB、溶劑有機相中，進行化合物II和化合物III的加成反應，形成C-N鍵，生成化合物I，合成路線如下：

其中，酶催化為無水催化，所述溶劑為DMSO。

其中，化合物II與化合物III的摩爾比為1:1～5。

其中，化合物II與CALB的質量比為1:5～30。

其中，化合物II與溶劑的質量體積比為1:10～100g/mL。

與現有技術相比，本發明的有益效果是：