[發明專利]一種檢測重組蛋白電荷變異體的方法及應用

有效

• 申請號: 202011359120.2
• 申請日: 2020-11-27
• 公開（公告）號: CN114563489B
• 公開（公告）日: 2023-09-12
• 發明（設計）人: 劉婭梅;武慧敏;金柳函
• 申請（專利權）人: 盛禾（中國）生物制藥有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/34;G01N30/36;G01N30/74;G01N30/88;G01N30/96
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本發明提供了一種檢測可特異性結合GPC3和CD3蛋白電荷變異體的方法及應用。該方法通過高效液相?離子交換色譜法對待測蛋白進行分析獲得色譜圖，確定該待測蛋白同源二聚體雜質和電荷變異體的含量；高效液相?離子交換色譜法所采用的流動相包括磷酸鹽的混合溶液；通過不同混合比例構成流動相A和流動相B。本發明能夠適用于結構復雜的可特異性結合GPC3和CD3蛋白的電荷變異體分析，解決了因試劑或前處理導致樣品變性和用傳統的高鹽洗脫?離子交換色譜法無法實現電荷異構體的分離等問題，可用于該類藥物的質量控制領域，確保藥物生產的批次一致性，監控臨床用藥的安全性與有效性，以及在檢測可特異性結合GPC3和CD3蛋白同源二聚體雜質和電荷變異體中的應用。

技術領域

本發明屬于重組蛋白檢測技術領域，涉及一種檢測可特異性結合GPC3和CD3蛋白同源二聚體雜質和電荷變異體的方法及應用。

背景技術

由真核系統表達的重組雙特異性抗體藥物由兩條不同的重鏈組成，這些重鏈隨機組合包含同源二聚體的雜質和電荷異質性目標產物。同源二聚體雜質是重組雙特異性抗體藥物的關鍵質量屬性，對重組雙特異性抗體藥物的穩定性、溶解性、免疫原性、體內外生物學活性、藥物動力學功能發揮等都具有重要的影響。分析重組雙特異性抗體藥物的同源二聚體可以了解藥物中雜質情況，是重組雙特異性抗體藥物質量控制必不可少的項目之一。

目前用于雙特異性抗體藥物電荷異質性和同源二聚體雜質的檢測方法主要有三種，即平板膠等電聚焦電泳、離子交換色譜、毛細管等電聚焦電泳技術(藥物生物技術，2018，25(5)：461-466)。平板膠等電聚焦電泳法可快速直觀地進行等電點區帶顯示，普及型較廣，但其操作繁瑣，分辨率低，準確定量困難。毛細管等電聚焦電泳法在分辨率及準確定量方面得到了一定的提升，但由于聚焦過程后需要通過機械或電場力將聚焦分離的各個組分推至檢測窗口進行檢測，會導致譜帶展寬及變形。離子交換色譜能同時分離由于蛋白質等電點不同以及空間電荷分布不一致而導致的電荷異構體，但由于交換層析介質限制，以及各項實驗參數優化的復雜性，離子交換色譜法對不同蛋白質相互分離效果也不確定。

由于在工業化生產過程中，重組雙特異性抗體藥物結構發生復雜性和多樣性的變化，因此選擇一種靈敏度高、特異性強的且能夠同時檢測重組雙特異性抗體藥物電荷異質性和同源二聚體雜質檢測分析方法是控制和穩定重組蛋白藥物生產質量的有效手段。

發明內容

本發明主要解決的技術問題是提供一種檢測可特異性結合GPC3和CD3蛋白同源二聚體雜質和電荷變異體的方法。本發明高效液相-離子交換色譜法能夠適用于結構復雜的可特異性結合GPC3和CD3蛋白的電荷變異體分析，解決了因試劑或前處理導致樣品變性和用傳統的高鹽洗脫-離子交換色譜法無法實現電荷異構體的分離等問題，可用于該類藥物的質量控制領域，確保藥物生產的批間一致性，監控臨床用藥的安全性與有效性。

為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下：

本發明提供一種檢測可特異性結合GPC3和CD3蛋白同源二聚體雜質和電荷變異體的含量的方法，其包括如下步驟：

通過高效液相色譜法-離子交換色譜法對待測蛋白進行分析獲得色譜圖，基于所述色譜圖，確定所述待測可特異性結合GPC3和CD3蛋白同源二聚體雜質和電荷變異體的含量；

所述高效液相色譜法-離子交換色譜法所采用的流動相包括磷酸鹽的混合溶液；通過不同混合比例構成流動相A和流動相B；

上述方法中，優選地，流動相A選用磷酸氫二鈉溶液，流動相B選用磷酸二氫鈉溶液。

上述方法中，優選地，所述的磷酸氫二鈉溶液為40mM，所述的磷酸二氫鈉溶液為40mM。

上述方法中，優選地，所述高效液相色譜法-離子交換色譜法采用的色譜柱包括陽離子交換色譜柱；優選地，所述色譜柱包括強陽離子交換色譜柱SCX。