[發明專利]一種鑒別中國甜柿的方法

在審

• 申請號: 202011359010.6
• 申請日: 2020-11-27
• 公開（公告）號: CN112301149A
• 公開（公告）日: 2021-02-02
• 發明（設計）人: 傅建敏;索玉靜;韓衛娟;王藝儒;李華威;刁松鋒;王麗媛;孫鵬
• 申請（專利權）人: 國家林業和草原局泡桐研究開發中心
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/6806
• 代理公司: 北京冠榆知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11666
• 代理人: 朱亞琦

1.一種鑒別中國甜柿的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)提取柿屬植物個體基因組DNA；

(2)以提取基因組DNA為模板，利用中國甜柿鑒別引物對CPCNA-3進行PCR擴增；

(3)對PCR擴增產物進行電泳分析。

2.根據權利要求1所述的一種鑒別中國甜柿的方法，其特征在于，在步驟(2)中，所述中國甜柿鑒別引物對CPCNA-3包括正向引物和反向引物，如序列表中SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示。

3.根據權利要求1所述的一種鑒別中國甜柿的方法，其特征在于，在步驟(1)中，用Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒提取柿樹的基因組DNA。

4.根據權利要求3所述的一種鑒別中國甜柿的方法，其特征在于，提取方法包括如下步驟：

(1-1)稱取50mg的新鮮植物葉片，液氮研磨，轉移至1.5ml離心管中；

(1-2)加750μL 65℃預熱的Buffer PCD和β-巰基乙醇混合物到含葉片粉末的離心管中，上下顛倒混勻，65℃水浴25min，5min混勻1次；Buffer PCD和β-巰基乙醇的體積比為50:1；

(1-3)加750μL氯仿，混勻，12000rpm離心5min，轉移400μL上清液至一個新的1.5ml離心管中；

(1-4)加400μLBuffer BD，混勻，再加入400μL無水乙醇，充分混勻后移入吸附柱，室溫靜置2min，10000rpm離心1min，倒掉收集管中的液體；

(1-5)加入500μLPW Solution與異丙醇的混合液到吸附柱中，室溫靜置2min，10000rpm離心1min，倒掉收集管中的液體，其中Solution與異丙醇的體積比為3:2；

(1-6)繼續加入500μL Wash Solution與無水乙醇的混合液到吸附柱中，室溫靜置2min，10000rpm離心1min，倒掉收集管中的液體，其中Wash Solution與無水乙醇的體積比為1:3；

(1-7)將吸附柱放回收集管中，12000rpm離心2min；

(1-8)取出吸附柱置于新的1.5mL離心管中，在吸附膜中央加50μL 60℃預熱的TEBuffer洗脫，靜置3min，12000rpm離心2min，重復步驟(1-8)1次；

(1-9)丟棄吸附柱，離心管中的液體即為獲得的柿基因組DNA，利用1.0％的瓊脂糖凝膠及紫外分光光度計檢測樣品的質量與濃度，樣品檢測合格后置于-20℃冰箱保存備用。

5.根據權利要求2所述的一種鑒別中國甜柿的方法，其特征在于，在步驟(2)中PCR擴增體系為25μl，反應組成為12.5μL的2x Taq PCR Master Mix，10μM/L的上游引物和下游引物各0.8μL，基因組DNA模板為0.9μL，最后加入ddH₂O 10μL。

6.根據權利要求2所述的一種鑒別中國甜柿的方法，其特征在于，在步驟(2)中，PCR擴增程序為：94℃預變性4min，94℃變性30s，49.4℃退火30s，72℃延伸30s，變性退火延伸共30循環，最后72℃延伸10min。

7.根據權利要求1所述的一種鑒別中國甜柿的方法，其特征在于，在步驟(3)中，擴增產物經1％瓊脂糖凝膠電泳分離，電泳分離的條件為：90V 30min，4S Red Plus染色，Marker為DNA分子量標準為100-2000bp。

8.根據權利要求1所述的一種鑒別中國甜柿的方法，其特征在于，電泳凝膠上出現418bp大小條帶對應的個體即為中國甜柿。