[發(fā)明專利]一種鑒別中國甜柿的方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202011359010.6 | 申請日： | 2020-11-27 |
| 公開（公告）號： | CN112301149A | 公開（公告）日： | 2021-02-02 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 傅建敏;索玉靜;韓衛(wèi)娟;王藝儒;李華威;刁松鋒;王麗媛;孫鵬 | 申請（專利權(quán)）人： | 國家林業(yè)和草原局泡桐研究開發(fā)中心 |
| 主分類號： | C12Q1/6895 | 分類號： | C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/6806 |
| 代理公司： | 北京冠榆知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11666 | 代理人： | 朱亞琦 |
| 地址： | 450003 *** | 國省代碼： | 河南;41 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 鑒別 中國 方法 | ||
本發(fā)明公開一種鑒別中國甜柿的方法，包括提取柿屬植物個體基因組DNA；(2)以提取DNA為模板，利用中國甜柿鑒別引物對CPCNA?3進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析。本發(fā)明引物對為鑒定中國甜柿專一性分子探針，根據(jù)樣品中是否有PCR擴(kuò)增條帶，即可判斷檢測個體是否為中國甜柿，鑒別準(zhǔn)確率達(dá)95％以上。該方法簡單、實(shí)用、靈敏度高，在柿種質(zhì)資源及雜交后代的鑒定中具有重要意義。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。具體地說是一種鑒別中國甜柿的方法。
背景技術(shù)
柿(Diospyros kaki Thunb.)為柿科(Ebenaceae)柿屬(Diospyros)植物，有“木本糧食”之稱。我國擁有世界上最為豐富的柿種質(zhì)資源，除大別山區(qū)有少數(shù)中國甜柿資源外，其余均為澀柿。中國原產(chǎn)完全甜柿最早于湖北羅田一帶發(fā)現(xiàn)，因此定名為‘羅田甜柿’，隨著柿資源調(diào)查的進(jìn)行，將鄂、豫、皖三省交界處大別山一帶的甜柿植物類群統(tǒng)稱為‘羅田甜柿’已不十分確切，我國學(xué)者于2002年建議將其更名為中國甜柿。
中國甜柿為完全甜柿類型，在果實(shí)硬食期即可自然脫澀，其自然脫澀機(jī)理以單寧的凝固效應(yīng)為主，有別于日本甜柿的稀釋效應(yīng)。中國原產(chǎn)完全甜柿內(nèi)部遺傳多樣性豐富，且控制自然脫澀性狀相關(guān)基因?yàn)轱@性，以中國甜柿和日本甜柿或主栽澀柿品種為親本進(jìn)行雜交，有利于開展以完全甜柿為育種目標(biāo)的工作。因此，有必要開發(fā)可鑒別中國甜柿的分子標(biāo)記，在育苗階段將完全甜柿篩選出來，節(jié)約了時間和成本，對提高了種質(zhì)創(chuàng)新與育種效率具有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容
為此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種鑒別中國甜柿的方法，可以篩選中國甜柿種質(zhì)資源和以中國甜柿為親本的雜交后代中完全甜柿。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
一種鑒別中國甜柿的方法，包括如下步驟：
(1)提取柿屬植物個體基因組DNA；
(2)以提取DNA為模板，利用中國甜柿鑒別引物對CPCNA-3進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
(3)對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析。
上述一種鑒別中國甜柿的方法，在步驟(2)中，所述中國甜柿鑒別引物對CPCNA-3包括正向引物和反向引物，如序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
上述一種鑒別中國甜柿的方法，在步驟(1)中，用Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒提取柿樹的基因組DNA。
上述一種鑒別中國甜柿的方法，提取方法包括如下步驟：
(1-1)稱取50mg的新鮮植物葉片，液氮研磨，轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中；
(1-2)加750μL 65℃預(yù)熱的Buffer PCD和β-巰基乙醇混合物到含葉片粉末的離心管中，上下顛倒混勻，65℃水浴25min，5min混勻1次；Buffer PCD和β-巰基乙醇的體積比為50:1；
(1-3)加750μL氯仿，混勻，12000rpm離心5min，轉(zhuǎn)移400μL上清液至一個新的1.5ml離心管中；
(1-4)加400μLBuffer BD，混勻，再加入400μL無水乙醇，充分混勻后移入吸附柱，室溫靜置2min，10000rpm離心1min，倒掉收集管中的液體；
(1-5)加入500μLPW Solution與異丙醇的混合液到吸附柱中，室溫靜置2min，10000rpm離心1min，倒掉收集管中的液體，其中Solution與異丙醇的體積比為3:2；
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