[發(fā)明專利]一種檢測紅細(xì)胞中甲氨蝶呤類物質(zhì)濃度的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202011350522.6
• 申請日: 2020-11-26
• 公開（公告）號: CN112666273A
• 公開（公告）日: 2021-04-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 成曉亮;李美娟
• 申請（專利權(quán)）人: 南京品生醫(yī)學(xué)檢驗實驗室有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/14;G01N30/34;G01N30/32;G01N30/54;G01N30/60;G01N30/72
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 黃欣

本發(fā)明公開了一種檢測紅細(xì)胞中甲氨蝶呤類物質(zhì)濃度的方法，屬于血液檢測技術(shù)領(lǐng)域。該方法是取預(yù)處理后的紅細(xì)胞樣本，先利用超高效液相色譜將甲氨蝶呤、二聚谷氨酸甲氨蝶呤、三聚谷氨酸甲氨蝶呤、四聚谷氨酸甲氨蝶呤、五聚谷氨酸甲氨蝶呤與紅細(xì)胞基質(zhì)進行分離，再利用質(zhì)譜同位素內(nèi)標(biāo)定量法，根據(jù)已經(jīng)建立的校準(zhǔn)曲線，計算甲氨蝶呤類藥物的含量。本發(fā)明的方法靈敏度高、特異性強、準(zhǔn)確且前處理過程較簡單，5.5 min之內(nèi)可完成分離和檢測，可用于臨床上甲氨蝶呤類物質(zhì)的定量分析，為臨床上甲氨蝶呤類物質(zhì)的治療濃度監(jiān)測提供一種可靠的檢測方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于血液檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測紅細(xì)胞中甲氨蝶呤類物質(zhì)濃度的方法。

背景技術(shù)

甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)主要用于治療惡性腫瘤：小劑量或一般劑量用于治療絨毛膜上皮細(xì)胞癌、急性淋巴白血病、乳腺癌和中樞神經(jīng)瘤(鞘內(nèi)注射)；大劑量治療骨肉瘤、頭頸部上皮樣癌、非霍奇金淋巴瘤、小細(xì)胞肺癌等。大劑量的甲氨蝶呤在血漿中比較容易監(jiān)測，但是小劑量的甲氨蝶呤在血漿中會被快速清除而很難被監(jiān)測到。

MTX主要通過葉酸載體進入細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞中，被葉酸聚谷氨酸合成酶迅速轉(zhuǎn)化合成甲氨蝶呤多聚谷氨酸。在競爭反應(yīng)中，多聚谷氨酸被降解為聚合度從2-7個多種長度的多聚谷氨酸甲氨蝶呤。在低劑量的MTX治療中，戊谷氨酸(MTXPG5)是檢測到的最高的谷氨酸，而MTX的三谷氨酸形式(MTXPG3)在治療中占主導(dǎo)地位。由于MTXPGn是MTX外排蛋白的底物，多谷氨酰化作用在細(xì)胞中保留了MTX。MTXPGn對葉酸和新嘌呤生物合成關(guān)鍵酶的抑制作用比MTX強幾個數(shù)量級。因此，MTXPGn是評估MTX暴露和自身免疫性風(fēng)濕病療效的關(guān)鍵客觀指標(biāo)。對長鏈MTXPGs(MTXPG3)的激活不良或依從性差導(dǎo)致的暴露不足可能限制某些患者獲得好的的臨床反應(yīng)，盡管與藥代動力學(xué)無關(guān)的其他機制顯然也與此相關(guān)。因此測定紅細(xì)胞內(nèi)MTXPGn水平和MTX的評估可以預(yù)測患者對治療的反應(yīng)，也可以用來評估患者對MTX治療的依從性。

細(xì)胞內(nèi)MTXPGn的濃度可以通過毛細(xì)管區(qū)帶電泳和柱后光氧化高效液相色譜等分析技術(shù)來測定。總細(xì)胞內(nèi)MTX也可以通過熒光偏振免疫測定或酶解后的聚谷氨酸，然后通過吸光度測量。然而，由于受到內(nèi)源性葉酸或其他MTX相關(guān)化合物的干擾，這些技術(shù)是費時費力的，因此不適合用于患者的常規(guī)測量。

目前，甲氨蝶呤的檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)和流質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS/MS)。HPLC-UV法專屬性較差、靈敏度較低、樣本用量大，且分析時間長，而LC-MS/MS法多采用液液萃取法處理血漿，操作繁瑣和耗時。比如，專利CN 110320302 A公開了一種快速測定甲氨蝶呤濃度的方法，該方法雖然前處理簡單，但只測定了甲氨蝶呤的濃度，未監(jiān)測主要聚合物。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)同時檢測紅細(xì)胞中甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)、二聚谷氨酸甲氨蝶呤(methotrexate diglutamate,MTXPG2)、三聚谷氨酸甲氨蝶呤(methotrexate triglutamate,MTXPG3)、四聚谷氨酸甲氨蝶呤(methotrexate tetrag-lutamate,MTXPG4)、五聚谷氨酸甲氨蝶呤(methotrexatepentaglutamate,MTXPG5)濃度的方法。該方法靈敏度高，同時監(jiān)測紅細(xì)胞中五種甲氨蝶呤類物質(zhì)，特異性好，對臨床監(jiān)測具有十分重要參考意義。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種檢測紅細(xì)胞中甲氨蝶呤類物質(zhì)濃度的方法，取預(yù)處理后的紅細(xì)胞樣本，先利用超高效液相色譜將甲氨蝶呤、二聚谷氨酸甲氨蝶呤、三聚谷氨酸甲氨蝶呤、四聚谷氨酸甲氨蝶呤、五聚谷氨酸甲氨蝶呤與紅細(xì)胞基質(zhì)進行分離，再利用質(zhì)譜同位素內(nèi)標(biāo)定量法，根據(jù)已經(jīng)建立的校準(zhǔn)曲線，計算甲氨蝶呤類藥物的含量；

所述標(biāo)準(zhǔn)曲線是以標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)物的濃度比為X軸，標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比為Y軸，所述內(nèi)標(biāo)物為MTX-d3。