[發明專利]一種檢測紅細胞中甲氨蝶呤類物質濃度的方法

在審

• 申請號: 202011350522.6
• 申請日: 2020-11-26
• 公開（公告）號: CN112666273A
• 公開（公告）日: 2021-04-16
• 發明（設計）人: 成曉亮;李美娟
• 申請（專利權）人: 南京品生醫學檢驗實驗室有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/14;G01N30/34;G01N30/32;G01N30/54;G01N30/60;G01N30/72
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 黃欣

1.一種檢測紅細胞中甲氨蝶呤類物質濃度的方法，其特征在于：取預處理后的紅細胞樣本，先利用超高效液相色譜將甲氨蝶呤、二聚谷氨酸甲氨蝶呤、三聚谷氨酸甲氨蝶呤、四聚谷氨酸甲氨蝶呤、五聚谷氨酸甲氨蝶呤與紅細胞基質進行分離，再利用質譜同位素內標定量法，根據已經建立的校準曲線，計算甲氨蝶呤類藥物的含量；

所述標準曲線是以標準品與內標物的濃度比為X軸，標準品與內標物的峰面積比為Y軸，所述內標物為MTX-d3。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述超高效液相色譜條件如下：

色譜柱：ACQUITY UPLC CSH C18，2.1×50 mm，1.7 μm；

流動相A為0.01～0.2%甲酸和1～10mM甲酸銨的混合水溶液，流動相B為甲醇；

采用流動相A和流動相B為混合流動相進行梯度洗脫的方式，在0-2.5分鐘內，流動相A和流動相B的體積比由100~90：0~10勻速漸變至40:60；在2.5-2.51分鐘內，流動相A和流動相B的體積比由40：60漸變至2:98；在2.51-3.0分鐘內，流動相A和流動相B的體積比保持為2:98；在3.0-3.01分鐘內流動相A和流動相B的體積比由2:98切換至98:2；在3.01-5.5分鐘內，流動相A和流動相B的體積比98：2保持不變；

流速為0.2~0.6 mL/min，柱溫為35~55℃，進樣體積為1~20 μL。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：所述流動相A為0.1%甲酸和5mM甲酸銨的混合水溶液。

4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：流動相A和流動相B的初始體積比為98：2，流速為0.3 mL/min，柱溫為40℃，進樣體積為10 μL。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述質譜條件如下：在電噴霧電離正離子檢測模式下，采用多反應監測的質譜掃描模式；毛細管電壓為3.0 kV；源溫度為150℃；脫溶劑氣溫度為400℃，脫溶劑氣流速為800 L/h，錐孔氣流速為150 L/h。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述預處理是向紅細胞中加入內標工作液，渦旋后加入蛋白沉淀劑，再渦旋離心后取上清液，氮吹和復溶后上機。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于：所述預處理是取50 μL樣本于1.5 mL離心管中，向其中加入20 μL內標工作液，渦旋，再加入180 μL預冷的蛋白沉淀劑，振蕩后超聲，取上清氮吹后加入復溶液復溶，然后取上清進樣。

8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于：所述內標工作液為5 ng/mL甲氨蝶呤-d3的0.1%甲酸水溶液。

9.根據權利要求6所述的方法，其特征在于：所述蛋白沉淀劑為甲醇和乙腈的混合溶液，甲醇和乙腈的體積比為1：4。

10.根據權利要求6所述的方法，其特征在于：所述復溶液為0.3%氨水。