[發(fā)明專利]松鼠葡萄球菌CY1-78及其在發(fā)酵制備溶纖酶中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011347963.0
• 申請(qǐng)日: 2020-11-26
• 公開（公告）號(hào): CN112300970B
• 公開（公告）日: 2022-05-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳虹;張建芬;謝廣發(fā);陸胤;孫亞媛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江樹人學(xué)院（浙江樹人大學(xué)）
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12N9/52;C12R1/44
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

本發(fā)明公開了一種松鼠葡萄球菌CY1?78及其在發(fā)酵制備溶纖酶中的應(yīng)用，將松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)CY1?78菌株接種入產(chǎn)酶培養(yǎng)基，于30–35℃、200–250r/min發(fā)酵24–32h，得發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)過(guò)離心后去除菌體，得到溶纖酶粗酶液，再經(jīng)過(guò)鹽析、透析和冷凍干燥后，得到溶纖酶凍干粉；本發(fā)明提供的產(chǎn)溶纖酶的松鼠葡萄球菌CY1?78菌株，生長(zhǎng)快、易培養(yǎng)，發(fā)酵周期短；松鼠葡萄球菌CY1?78菌株產(chǎn)溶纖酶活性高，在優(yōu)選的條件下，搖瓶發(fā)酵的酶活可達(dá)1553U/mL；溶纖酶的分離純化工藝簡(jiǎn)單，經(jīng)鹽析和透析脫鹽后，溶纖酶的凍干粉活力達(dá)到4030U/mg。

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株松鼠葡萄球菌(Staphylococcussciuri)及其在發(fā)酵制備溶纖酶中的應(yīng)用。

(二)背景技術(shù)

血栓性疾病嚴(yán)重危害人類的健康，其特征是血液中有形成分在血管內(nèi)形成血栓，造成血管部分或完全堵塞，從而引起相應(yīng)組織或器官缺氧、缺血及壞死。常見的血栓性疾病主要包括心肌梗塞、心絞痛、腦血栓中風(fēng)、肺梗塞等。血栓性疾病不僅死亡率高且致殘率高，發(fā)病率遠(yuǎn)高于癌癥。隨著人們飲食習(xí)慣的改變和壽命的延長(zhǎng)，血栓性疾病的發(fā)病率也正在逐年提高。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，世界每年約2600萬(wàn)人死于心腦血栓疾病，血栓性疾病已成為全球人口死亡第一病因。

治療血栓性疾病的藥物有溶栓藥物、抗血小板藥物和抗凝劑，最為有效且可靠的方法是溶栓藥物治療，目前使用的溶栓藥物主要是溶纖酶類。溶纖酶是能夠水解血液中纖維蛋白一類蛋白酶的總稱，包括組織溶酶原激活劑、鏈激酶、尿激酶、蚓激酶和納豆激酶等。目前臨床上使用溶纖酶藥物均存在一些不足，如易導(dǎo)致出血、半衰期短、口服無(wú)效、價(jià)格高等。因此仍需尋找半衰期長(zhǎng)、無(wú)毒副作用、適用口服、成本低的新來(lái)源溶纖酶。

動(dòng)物、植物和微生物都可以產(chǎn)生溶纖酶，如來(lái)自蚯蚓的蚓激酶、來(lái)自中藥蒲黃的溶纖酶；來(lái)自溶血性鏈球菌的鏈激酶，來(lái)自納豆枯草桿菌的納豆激酶。相比之下，微生物因其種類多、產(chǎn)酶活性高、生長(zhǎng)快、生產(chǎn)成本低，是溶纖酶最佳來(lái)源。

家蠶的蠶蛾出繭時(shí)，口腔吐出含有溶繭酶的弱堿性液體，水解粘著繭絲的絲膠及部分絲素，使蠶繭結(jié)構(gòu)變?yōu)槭杷桑缓笥眯刈銚荛_已松解的繭絲，形成一個(gè)孔，再?gòu)目字秀@出。溶繭酶成分來(lái)源于蠶蛾的下腭和中腸，不同來(lái)源的酶協(xié)同作用水解繭層。來(lái)自下腭的溶繭酶成分由蠶蛾自己分泌，而來(lái)自中腸的溶繭酶可能由腸道中的微生物產(chǎn)生。蠶蛹在羽化過(guò)程中，腸道微生物生長(zhǎng)非常旺盛，產(chǎn)生大量的蛋白酶，這些蛋白酶不僅具有水解絲膠絲素的活性，而且可能還具有其他蛋白的活性，如溶纖酶活性。

為了獲得活力高、生產(chǎn)成本低、溶纖專一性強(qiáng)的溶纖酶，本發(fā)明從羽化前的蠶蛹腸道中分離產(chǎn)溶纖酶的微生物，經(jīng)過(guò)誘變和篩選，優(yōu)化產(chǎn)酶發(fā)酵工藝，開發(fā)一種新的微生物來(lái)源的溶纖酶及其生產(chǎn)工藝。

(三)發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一株新的溶纖酶產(chǎn)生菌—松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)CY1-78菌株，及其在制備溶纖酶中的應(yīng)用，利用該菌株發(fā)酵制備溶纖酶，具有發(fā)酵酶活單位高、周期短、分離純化工藝簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，制備的溶纖酶具有成本低、活性高的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

本發(fā)明提供一株新的溶纖酶產(chǎn)生菌—松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)CY1-78菌株，保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號(hào)：GDMCC No:61273，保藏日期2020年11月5日，地址：廣州市先烈中路100號(hào)大院59號(hào)樓5樓，郵編：510075。

本發(fā)明所述松鼠葡萄球菌CY1-78菌株是從羽化前的家蠶蠶蛹腸道中分離，并經(jīng)過(guò)紫外線誘變，從突變株中篩選獲得。所述松鼠葡萄球菌CY1-78菌株的培養(yǎng)特征如下：該菌株接種于LB平板培養(yǎng)基上，37℃下培養(yǎng)24h后，可見乳白色菌落，菌落不透明，邊緣整齊，表面光滑(菌落照片見附圖1)。將所述松鼠葡萄球菌CY1-78菌株接種在脫脂牛奶平板培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h后，在菌落周圍形成較大的透明圈(菌落照片見附圖2)。