[發(fā)明專利]一種犬促甲狀腺激素檢測試劑盒及其檢測方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202011342858.8 | 申請日： | 2020-11-26 |
| 公開（公告）號： | CN112540181A | 公開（公告）日： | 2021-03-23 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 李婷;馮小龍;孫云雷;張施羽;錢翀;王蓉蓉 | 申請（專利權(quán)）人： | 愛若維生物科技（蘇州）有限公司 |
| 主分類號： | G01N33/76 | 分類號： | G01N33/76;G01N33/577;G01N33/58;G01N33/543;G01N33/535;C07K16/26 |
| 代理公司： | 蘇州威世朋知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32235 | 代理人： | 楊林潔 |
| 地址： | 215123 江蘇省蘇州市中國(江蘇)自由貿(mào)易試驗區(qū)*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 甲狀腺 激素 檢測 試劑盒 及其 方法 | ||
1.一種犬促甲狀腺激素檢測試劑盒，其特征在于，包括微孔板、酶標液、封閉試劑、顯色試劑、樣品稀釋液、標準樣品和終止試劑，其中，所述微孔板上預(yù)包被犬促甲狀腺激素單克隆抗體Ⅰ，所述酶標液為HRP標記的犬促甲狀腺激素單克隆抗體Ⅱ。
2.如權(quán)利要求1所述的犬促甲狀腺激素檢測試劑盒，其特征在于，所述犬促甲狀腺激素單克隆抗體Ⅰ由犬促甲狀腺激素重組抗原Ⅰ經(jīng)免疫制備而得；所述犬促甲狀腺激素單克隆抗體Ⅱ由犬促甲狀腺激素重組抗原Ⅱ經(jīng)免疫制備而得。
3.如權(quán)利要求2所述的犬促甲狀腺激素檢測試劑盒，其特征在于，所述犬促甲狀腺激素單克隆抗體Ⅰ是經(jīng)如下免疫方法制備而得：
S1、將200μg犬促甲狀腺激素重組抗原Ⅰ與弗氏完全佐劑等量混合均勻，乳化后，向選用的第一只6周齡Balb/c雌小鼠的腹腔內(nèi)注射100μl，每隔2～3周，對選用的所述第一只6周齡Balb/c雌小鼠進行加強免疫；
S2、以純?nèi)偌谞钕偌に刂亟M抗原Ⅰ注射小鼠腹腔和尾靜脈各50μg，3d后取所述第一只6周齡Balb/c雌小鼠的脾細胞，無菌條件下，將所述第一只6周齡Balb/c雌小鼠的脾細胞和SP2/0細胞進行融合，使融合后的細胞在HAT培養(yǎng)基中生長，置于有飼養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)板中；
S3、通過陽性克隆篩選和克隆化培養(yǎng)得到雜交瘤細胞株Ⅰ，將所述雜交瘤細胞株Ⅰ接種于預(yù)先用誘導(dǎo)劑處理的第二只6周齡Balb/c雌小鼠，收取腹水，純化后，用ELISA法測定抗體效價，得到犬促甲狀腺激素單克隆抗體I。
4.如權(quán)利要求2所述的犬促甲狀腺激素檢測試劑盒，其特征在于，所述犬促甲狀腺激素單克隆抗體Ⅱ是經(jīng)如下免疫方法制備而得：
S1、將200μg犬促甲狀腺激素重組抗原Ⅱ與弗氏完全佐劑等量混合均勻，乳化后，向選用的第三只6周齡Balb/c雌小鼠的腹腔內(nèi)注射100μl，每隔2～3周，對選用的所述第三只6周齡Balb/c雌小鼠進行加強免疫；
S2、以純?nèi)偌谞钕偌に刂亟M抗原Ⅱ注射小鼠腹腔和尾靜脈各50μg，3d后取所述第三只6周齡Balb/c雌小鼠的脾細胞，無菌條件下，將所述第三只6周齡Balb/c雌小鼠的脾細胞和SP2/0細胞進行融合，使融合后的細胞在HAT培養(yǎng)基中生長，置于有飼養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)板中；
S3、通過陽性克隆篩選和克隆化培養(yǎng)得到雜交瘤細胞株Ⅱ，將所述雜交瘤細胞株Ⅱ接種于預(yù)先用誘導(dǎo)劑處理的第四只6周齡Balb/c雌小鼠，收取腹水，純化后，用ELISA法測定抗體效價，得到犬促甲狀腺激素單克隆抗體Ⅱ。
5.如權(quán)利要求1所述的犬促甲狀腺激素檢測試劑盒，其特征在于，所述封閉試劑為含有0.01％Proclin200的5％的牛奶，所述樣品稀釋液為0.01mol/L的PBS緩沖溶液，所述顯色試劑為ABTS，所述終止試劑為1.25％的NaF溶液，所述微孔板為NUNC板，所述標準樣品中促甲狀腺激素的含量為0.2ug/ml。
6.如權(quán)利要求1所述的犬促甲狀腺激素檢測試劑盒，其特征在于，在所述微孔板上包被犬促甲狀腺激素單克隆抗體Ⅰ的步驟如下：
S1、應(yīng)用碳酸鹽緩沖溶液對犬促甲狀腺激素單克隆抗體Ⅰ進行稀釋；
S2、將稀釋后的犬促甲狀腺激素單克隆抗體Ⅰ按100ul/孔的加入量加入所述微孔板內(nèi)，4℃下靜置包被，包被后將多余的犬促甲狀腺激素單克隆抗體Ⅰ吸去；
S3、應(yīng)用所述封閉試劑對包被后的所述微孔板進行封閉，棄去多余的所述封閉試劑，扣干；
S4、將所述微孔板置于室溫真空環(huán)境下干燥，得到預(yù)包被犬促甲狀腺激素單克隆抗體Ⅰ的微孔板，真空密封環(huán)境下保存，備用。
7.如權(quán)利要求6所述的犬促甲狀腺激素檢測試劑盒，其特征在于，步驟S1中，稀釋后所述犬促甲狀腺激素單克隆抗體Ⅰ的濃度為0.1mg/ml～0.25mg/ml；步驟S2中，所述靜置包被的時間為15h～23h；步驟S3中，所述封閉的時間為30min。
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