[發(fā)明專利]一種PD-1敲除的CD19CAR-T細(xì)胞的構(gòu)建方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011338905.1
• 申請日: 2020-11-25
• 公開（公告）號: CN112458116B
• 公開（公告）日: 2023-04-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉爽;張青;張普民
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州重磅生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 北京華清迪源知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11577
• 代理人: 孫志一

本發(fā)明公開了一種PD?1基因敲除的CD19CAR?T細(xì)胞的構(gòu)建方法，所述方法包括：采用Nucleofector細(xì)胞核技術(shù)，將含有CD19的單鏈抗體可變區(qū)基因片段的PiggyBac載體質(zhì)粒Piggybac?CAR?CD19，轉(zhuǎn)座酶表達(dá)質(zhì)粒Piggybac?Transposase，含有能成功靶向PD1基因的sgRNA表達(dá)質(zhì)粒pGL3?U6?hPD1sg1，以及pST1374?NLS?flag?Cas9?ZF質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入T細(xì)胞，得到PD?1基因敲除的CD19?CAR?T細(xì)胞。本發(fā)明實驗證明：PD?1敲除的免疫細(xì)胞較PD?1未敲除的CD19?CAR?T細(xì)胞，具有更高的細(xì)胞殺傷能力。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)，特別是涉及一種新的PD-1敲除的CD19CAR-T細(xì)胞的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

CAR-T(Chimeric?Antigen?Receptor?T-Cell?Immunotherapy，嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法)是近年來發(fā)展起來的新的過繼免疫細(xì)胞治療手段，通過基因工程手段修飾T細(xì)胞，使其表達(dá)嵌合抗原受體，嵌合抗原受體可以特異性識別腫瘤相關(guān)抗原靶點，識別結(jié)合后將激活增殖T細(xì)胞的信號傳遞至胞內(nèi)，引起T細(xì)胞激活和增殖，從而有效殺傷腫瘤細(xì)胞。CAR分子大致可分為5代演變：I代，特異性T細(xì)胞激活；II代，增加共刺激因子，提高細(xì)胞毒性；III代，同時具有兩個共刺激因子，提高T細(xì)胞增殖能力與殺傷毒性；IV代，整合自殺基因，精確調(diào)控，細(xì)胞因子釋放(如IL-7，IL-15)激活等；V代，通用型CAR。與普通的免疫細(xì)胞治療相比，CAR-T技術(shù)具有許多獨特的優(yōu)勢，如CAR能非MHC依賴性識別腫瘤抗原，不需要經(jīng)過APC。腫瘤表面蛋白類和脂類抗原都可以作為靶點；有共刺激分子，能有效增強T細(xì)胞增殖。因此該技術(shù)被認(rèn)為是有望徹底攻克人類癌癥的獨特方法。

目前，CAR-T免疫治療已在許多臨床實驗上取得巨大進(jìn)展。其中，針對B相關(guān)抗原CD19陽性的B細(xì)胞惡性腫瘤，如急性B-淋巴細(xì)胞白血病(B-ALL)，慢性B-淋巴細(xì)胞白血病(B-CLL)，B細(xì)胞霍奇金氏淋巴瘤(B-HL)和非霍奇金氏淋巴瘤(B-NHL)，CAR-T-CD19T細(xì)胞免疫治療療效顯著，已有報告顯示CAR-T-CD19治療在成人和兒童復(fù)發(fā)和難治性B-ALL中可以獲得高達(dá)90％的完全緩解率(Complete?remission，CR)。研究報告也顯示，幾種用不同結(jié)構(gòu)設(shè)計的CAR-CD19的臨床試驗治療都顯示了相似的良好療效。有些患者經(jīng)CAR-T治療后還獲得了持久性緩解，不需要額外的其他治療。

盡管如此，該治療仍有許多環(huán)節(jié)需要改進(jìn)，如能否找到更好的受體、更好的載體、更好的協(xié)同刺激分子等，其中轉(zhuǎn)染載體的安全性和有效性對于臨床治療尤為關(guān)鍵。現(xiàn)今，CAR主要的轉(zhuǎn)染模式包括慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、電轉(zhuǎn)染等方式，病毒載體盡管具有較好的轉(zhuǎn)染效率，但存在因基因組整合引起插入突變的風(fēng)險，因此，利用非病毒載體結(jié)合電轉(zhuǎn)技術(shù)，不需要病毒的介入，可獲得與病毒感染效率相當(dāng)甚至更高的轉(zhuǎn)染結(jié)果，避免了病毒核酸隨機插入宿主細(xì)胞，影響細(xì)胞正常生長以及后續(xù)可能的病變，是提升CAR-T細(xì)胞療法的安全性的重要環(huán)節(jié)。亟待研發(fā)這一種新的構(gòu)建CD19CAR-T細(xì)胞的方法

PD-1(programmed?death?1)程序性死亡受體1，是一種重要的免疫抑制分子，為免疫球蛋白超家族，是一個268氨基酸殘基的膜蛋白。PD1的主要功能是限制外周組織的效應(yīng)T細(xì)胞活性。腫瘤細(xì)胞表達(dá)的PD1配體和T細(xì)胞的PD1結(jié)合，抑制T細(xì)胞激活相關(guān)激酶，從而抑制效應(yīng)T細(xì)胞活性。利用PD1單克隆抗體(MDX-1106、MK3475、CT-011、AMP-224等)，抑制PD1配體和PD1結(jié)合，從而達(dá)到治療腫瘤的效果。

但是，利用PD1抗體的治療只在黑色素癌療效較好，對腎癌和肺癌有部分療效。因為利用抗體進(jìn)行靶基因的治療還受到一些因素的限制：(1)抗體的作用只是暫時阻斷的作用；(2)抑制性受體有多種，如何利用多種抗體同時阻斷多種抑制性受體還沒有對策；(3)不容易研發(fā)出有效的抗體；(4)只針對細(xì)胞外靶點；(5)抗體藥物昂貴等。

CRISPR-Cas9快速、簡便、高效、特異性靶向敲除基因，通過靶向敲除PD1基因，為實現(xiàn)腫瘤免疫治療提供了一種可行的策略。