[發明專利]一種PD-1敲除的CD19CAR-T細胞的構建方法

有效

• 申請號: 202011338905.1
• 申請日: 2020-11-25
• 公開（公告）號: CN112458116B
• 公開（公告）日: 2023-04-14
• 發明（設計）人: 劉爽;張青;張普民
• 申請（專利權）人: 廣州重磅生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 北京華清迪源知識產權代理有限公司 11577
• 代理人: 孫志一

1.一種PD-1基因敲除的CD19CAR-T細胞的構建方法，其特征在于，所述方法包括：

確定CD19的單鏈抗體可變區基因片段，設計合成CD19單鏈抗體；

依次連接的CD8信號肽、CD19單鏈抗體、CD8鉸鏈及跨膜區、胞內4-1BB、胞內CD3ζ融合而成的目的基因連接到pMD?18-Tsimple?vector上；

采用酶切、連接和轉化的方法，將目的基因連接到PiggyBac載體上，并測序檢測合成正確的目的基因片段產物轉入到大腸桿菌感受態TOP10，使含CD19的單鏈抗體可變區基因片段的PiggyBac載體在大腸桿菌中表達；

采用?Nucleofector?細胞核技術，將含有?CD19?的單鏈抗體可變區基因片段的PiggyBac載體質粒Piggybac-CAR-CD19，轉座酶表達質粒Piggybac?Transposase，含有能成功靶向?PD1?基因的?sgRNA?表達質粒?pGL3-U6-hPD1sg1，以及?pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF?質粒共轉染入T?細胞，得到?PD-1?基因敲除的CD19?CAR-T?細胞；

所述CD19單鏈抗體包括重鏈可變區和輕鏈可變區，重鏈可變區和輕鏈可變區之間通過連接肽連接，重鏈可變區包括重鏈可變區互補決定區1?CDR-H1、重鏈可變區互補決定區2CDR-H2和重鏈可變區互補決定區3?CDR-H3；

輕鏈包括輕鏈可變區，輕鏈包括輕鏈可變區互補決定區1?CDR-L1、輕鏈可變區互補決定區2?CDR-L2和輕鏈可變區互補決定區3?CDR-L3；

所述CD19單鏈抗體的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示；

所述CD19單鏈抗體的編碼核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；

所述CD8鉸鏈及跨膜區氨基酸序列如SEQ?ID?No.4所示；

所述胞內4-1BB的氨基酸序列如SEQ?ID?No.5所示；

所述胞內CD3ζ的氨基酸序列如SEQ?ID?No.6所示。

2.如權利要求1所述的PD-1基因敲除的CD19CAR-T細胞的構建方法，其特征在于，

所述含有能成功靶向PD1基因的sgRNA表達質粒pGL3-U6-hPD1sg1質粒的構建過程為：

設計和合成特異性靶向人PD-1基因的sg?RNA寡核苷酸，所述sgRNA在PD-1基因上的靶序列符合5’-GGN(19)GG、5’-GN(20)GG或者5’-N(21)GG的序列排列規則；所述sgRNA在PD-1基因上的靶序列位于基因的外顯子；所述sgRNA在PD-1基因上的靶序列位于不同的各種剪切形式的共有外顯子上；所述sgRNA在PD-1基因上的靶序列是唯一的；

所述sg?RNA寡核苷酸對應的DNA序列如SEQID?NO：7所示，在其對應DNA序列的5’加上CCGG，如果序列本身在5’端已經有1或者2個G，那么就對應的省略1或者2個G，合成得到正向寡核苷酸即Forward?oligo；

所述的sgRNA獲得其對應DNA序列的互補鏈，并且在互補鏈的5’加上AAAC合成得到反向寡核苷酸即Reverse?oligo；

將合成的1對互補的sgRNA寡聚核苷酸的forward?oligo和reverse?oligo成對變性、退火，退火之后形成可以連入U6真核表達載體的雙鏈sgRNA寡聚核苷酸；

線性化載體pGL3-U6-sgRNA質粒；將退火的雙鏈sgRNA寡聚核苷酸與線性化pGL3-U6-sgRNA質粒連接獲得pGL3-U6-hPD1sg質粒；

?pGL3-U6-hPD1sg質粒轉化感受態細菌并涂Amp+平板，挑選陽性克隆并用通用引物U6測序的方法鑒定出陽性克隆；37℃搖床搖陽性克隆菌過夜并用AxyPrep?Plasmid?MiniprepKit抽提，得到pGL3-U6-hPD1sg質粒。