[發明專利]一種引物探針組及其應用和一種檢測蜜蜂慢性麻痹病毒的試劑盒

在審

• 申請號: 202011338417.0
• 申請日: 2020-11-25
• 公開（公告）號: CN112458206A
• 公開（公告）日: 2021-03-09
• 發明（設計）人: 張體銀;鄭騰;黃嫦嬌;王武軍;張志燈;于師宇
• 申請（專利權）人: 福州海關技術中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京睿智保誠專利代理事務所(普通合伙) 11732
• 代理人: 周新楣

本發明屬于生物技術領域，本發明提供了一種引物探針組及其應用和一種檢測蜜蜂慢性麻痹病毒的試劑盒。本發明提供的引物探針組，包括上游引物、下游引物和TaqMan探針；本發明提供的引物探針組用于蜜蜂慢性麻痹病毒的檢測。本發明具有以下優點：(1)良好的穩定性和特異性：對蜜蜂慢性麻痹病毒的檢測具有高度特異性，與其它蜜蜂病毒無交叉反應，且重復性好；(2)靈敏度高：靈敏度能達到約10拷貝/μL；(3)操作簡便、快速：整個反應可在60min內完成；本發明提供的引物探針組及其試劑盒用于蜜蜂慢性麻痹病毒的檢測以及與其他蜜蜂病毒病的鑒別診斷，對于保障我國養蜂業和自然生態的健康發展具有重要意義。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種引物探針組及其應用和一種檢測蜜蜂慢性麻痹病毒的試劑盒。

背景技術

蜜蜂慢性麻痹病又叫黑蜂病、癱瘓病，是由蜜蜂慢性麻痹病毒(chronic beeparalysis virus，簡稱CBPV)引起的一種成年蜜蜂傳染病。該病全年都可發生，大多在春秋季流行，傳染很快，病情嚴重，頑固難治。

CBPV主要侵襲成年工蜂，被CBPV感染的蜂群可同時出現2種典型的麻痹病癥，即Ⅰ型麻痹綜合癥和Ⅱ型麻痹綜合癥。Ⅰ型麻痹綜合癥表現為患病蜜蜂身體和雙翅不正常的震顫，失去飛行能力，只能爬行。伴有腹部腫脹、下痢和雙翅無法閉合等明顯的病癥。患病蜜蜂個體出現病癥后數日內死亡。嚴重時使得蜂群崩潰，多發于盛夏高溫季節。Ⅱ型麻痹綜合癥又被稱為“黑盜蜂”、“黑小蜂”或“脫毛黑蜂癥”等。患病蜜蜂個體初期具有飛行能力，身體絨毛逐漸脫落，體色加深變黑。病蜂個體看起來比健康蜜蜂小，并有一個相對突出、有油亮光澤的腹部。可觀察到被同群健康蜜蜂攻擊的現象，類似盜蜂時的進攻行為。數日后，染病蜜蜂出現失去飛行能力、身體不停顫抖等麻痹癥狀，之后在短時間內死亡。蜜蜂緩慢性麻痹病毒病全年均可發生，但多在春夏兩季流行。法國在2007至2009年期間發生了嚴重的蜜蜂病害，許多出現麻痹病癥的蜜蜂與染病蜜蜂體內高濃度的CBPV有明顯的相關性。

目前對蜜蜂病毒病的檢測主要采用免疫學檢測和核酸分子檢測技術。免疫檢測是目前一種常用的快速檢測病毒的方法，但是蜜蜂很多病毒之間具有高度的基因同源性，應用免疫學技術會造成蜜蜂病毒檢測特異性較差，很難對蜜蜂病毒病進行準確診斷。基于核酸分子的PCR檢測技術與免疫檢測技術相比，PCR技術在病原體檢測方面已取得革命性的成功，成為核酸快速檢測的一個金標準，具有敏感度高、特異性強、簡便、快速而且準確，是目前最常用的，也是實驗室主要采用的檢測技術之一。實時熒光RT-PCR方法通過利用熒光探針使特異性進一步增強，直接顯示擴增結果，而無需電泳檢測，更縮短了檢測時間。

目前，檢測CBPV的實時熒光RT-PCR試劑盒還未見報道，該技術彌補目前國內有關蜂類疫病檢測的技術需求，對于保障我國養蜂業和自然生態的健康發展具有重要意義。

發明內容

本發明的目的在于提供一組檢測蜜蜂慢性麻痹病毒的實時熒光RT-PCR特異性引物探針組及其試劑盒，以彌補現有檢測技術的不足。本發明利用CBPV基因特異的保守序列設計引物和探針，通過對實時熒光RT-PCR反應體系的優化，利用實時熒光RT-PCR系統檢測蜜蜂慢性麻痹病毒。該方法具有特異性強、靈敏度高、操作簡單的特點，能夠對進境非人靈長類動物的蜜蜂慢性麻痹病毒進行快速、準確的檢疫和鑒定。

為了實現上述發明目的，本發明提供了以下技術方案：

本發明提供了一種引物探針組，所述引物探針組包括上游引物、下游引物和TaqMan探針；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述TaqMan探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

優選的，所述TaqMan探針5’端標記有熒光報告基團FAM，3’端標記有熒光淬滅基團BHQ1。

本發明還提供了一種所述引物探針組在制備檢測蜜蜂慢性麻痹病毒的試劑盒中的應用。