[發明專利]一種測定同位素稀釋超高效液相色譜質譜聯用方法

有效

• 申請號: 202011338317.8
• 申請日: 2020-11-25
• 公開（公告）號: CN112505179B
• 公開（公告）日: 2022-08-16
• 發明（設計）人: 何永鵬;李詠生;單娟娟;李麗仙;張海偉;李佳濤;趙化侃;王夢竹
• 申請（專利權）人: 重慶大學附屬腫瘤醫院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/14
• 代理公司: 重慶信航知識產權代理有限公司 50218
• 代理人: 穆祥維

本發明公開了一種測定同位素稀釋超高效液相色譜質譜聯用方法，步驟如下：1)選取三種目標化合物：吡哆醛；5?甲基四氫葉酸；甲鈷胺；2)以目標化合物與其同位素內標的濃度比為X軸，目標化合物與其同位素內標的峰面積比為Y軸，建立校正曲線，計算上述三種水溶性維生素的含量；3)蛋白沉淀劑配制；4)血清樣本的前處理；5)標準曲線的配制與處理。運用蛋白沉淀與液液萃取相結合的前處理方式對血清樣本處理，一方面使樣本中蛋白質變性沉降得以去除，另一方面脂類雜質得到去除，使處理后的樣本在檢測過程中受較少基質的干擾；運用相對簡便的前處理方式，及快速的檢測方法，建立一種能同時檢測多種水溶性維生素代謝產物。

技術領域

本發明涉及一種測定血清中多種水溶性維生素代謝產物的同位素的液相色譜質譜聯用方法，尤其涉及一種測定血清中多種水溶性維生素代謝產物的同位素稀釋超高效液相色譜質譜聯用方法。

背景技術

水溶性維生素(water-soluble vitamins)是能在水中溶解的一組維生素，是輔酶或輔基的組成部分。主要包括在酶的催化中起著重要作用的B族維生素，其代謝產物含量是判斷人體健康水平的重要依據。如維生素B6又叫吡哆素，在蛋白質的代謝過程中起調控作用，它有助于能量的產生，讓人感覺精力充沛，被稱為提神營養素，吡哆醛是維生素B6的主要代謝產物，是在肝臟醛氧化酶的作用下產生的。5-甲基四氫葉酸是葉酸最具生物活性和功能的形式，是葉酸參與生理代謝的唯一途徑，也是出現在動物血漿和細胞游離葉酸存在的唯一形式，主要用于藥物活性成分和食品添加劑，有預防胎兒神經管缺陷、動脈硬化，治療巨幼紅細胞性貧血，增強氟化嘧啶的治療效果，治療例如牛皮癬和風濕性關節炎的自身免疫疾病。甲鈷胺為維生素B12衍生物，通過化學結構命名，應該叫“甲基維生素B12”，其甲基化的官能基團可參與機體生化過程中的甲基轉移活動，對神經組織的核酸、蛋白質和脂肪代謝有促進作用，可刺激雪旺氏細胞卵磷脂合成，修復損傷髓鞘，改善神經傳導速度，可直接進入神經細胞，并刺激軸突受損區再生，刺激神經細胞的蛋白質合成，加強軸突的合成代謝，防止軸突變性，參與核酸合成，促進造血機能。

目前，有關水溶性維生素代謝產物的檢測方法有很多種，如微生物檢測法、ELISA、放射免疫分析，蛋白質結合或生物傳感器等方法。微生物檢測方法適用于檢測多種衍生物的總和(如總葉酸)，其它方法在代謝物的區分上存在相同的缺點。而液相色譜串聯質譜法(LC-MS/MS)能夠區分開天然維生素及其代謝產物，靈敏度高，特異性強，非常適用于血清或血漿中多種水溶性維生素代謝產物的檢測。但是，目前的LC-MS/MS技術檢測水溶性維生素時仍然存在諸多問題，如靈敏度不夠、前處理復雜和樣本用量大等。

CN201910387449.0闡明了“一種多種水溶性維生素含量的測定方法”，采用LC-MS法對血樣中5種水溶性維生素進行了檢測，缺乏對指標的明確化說明，且對方法中的驗證數據相對較少，僅進行了線性說明。

CN 201910837920.1發明名稱“一種檢測血液中水溶性維生素的方法”，采用LC-MS法對血樣中11種水溶性維生素進行了檢測，該專利雖然所分析的維生素較多，但僅使用的蛋白沉淀去除蛋白和基質能力較差，且一針分析時間為 15min，在臨床檢測中難以應用。

發明內容

水溶性維生素的代謝物是一類龐大而復雜的家族，不同代謝產物的化學性質和極性差異較大。因此，將幾類樣品前處理技術聯用，如蛋白沉淀與液液萃取相結合，既能提高待測物的純化效果，又能提高檢測的靈敏度和重現性，非常適合臨床復雜樣本的分析，本發明的目的正是在于提供這樣一種準確性好、靈敏度高的測定同位素稀釋超高效液相色譜質譜聯用方法。

為了解決上述技術問題，本發明采用了如下技術方案：

一種測定同位素稀釋超高效液相色譜質譜聯用方法，該方法包括如下步驟：

1)選取三種目標化合物

三種目標化合物分別為：吡哆醛(PL，吡哆醛)；5-甲基四氫葉酸(5-甲基四氫葉酸)；甲鈷胺(MeB12，甲鈷胺)；