[發明專利]一種測定同位素稀釋超高效液相色譜質譜聯用方法

有效

• 申請號: 202011338317.8
• 申請日: 2020-11-25
• 公開（公告）號: CN112505179B
• 公開（公告）日: 2022-08-16
• 發明（設計）人: 何永鵬;李詠生;單娟娟;李麗仙;張海偉;李佳濤;趙化侃;王夢竹
• 申請（專利權）人: 重慶大學附屬腫瘤醫院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/14
• 代理公司: 重慶信航知識產權代理有限公司 50218
• 代理人: 穆祥維

1.一種測定同位素稀釋超高效液相色譜質譜聯用方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：

1)選取三種目標化合物

三種目標化合物分別為：吡哆醛；5-甲基四氫葉酸；甲鈷胺；

2)利用同位素內標法進行定量，以目標化合物與其同位素內標的濃度比為X軸，目標化合物與其同位素內標的峰面積比為Y軸，建立校正曲線，計算上述三種水溶性維生素的含量；

3)蛋白沉淀劑按照如下方法配制得到：分別移取10μL 100μg/mL吡哆醛-d3、10μL 100μg/mL 5-甲基四氫葉酸-d5、20μL 10μg/mL甲鈷胺-d3，加甲醇定容至1mL，配制成混合內標液，再準確移取100μL混合內標液，用50％甲醇乙腈定容至10mL，配制成內標濃度分別為10.0ng/mL吡哆醛-d3、10.0ng/mL 5-甲基四氫葉酸-d5、2.0ng/mL甲鈷胺-d3蛋白沉淀劑；

4)血清樣本的前處理：

4.1)準確移取200μL血清樣本，加入含有三種內標的蛋白沉淀劑500μL，渦旋混勻3min，再加入600μL 80％正己烷/乙酸乙酯，v/v，渦旋混勻3min，于4℃，15000rpm離心10min；

4.2)取中間層500μL置于新的1.5mL EP管中，避光氮吹30min至近干，再加入溶劑溶解，渦旋混勻3min，于4℃，15000rpm離心2min；取100μL于96孔樣品板中，上機檢測；

5)標準曲線的配制與處理

5.1)分別準確稱取10.0mg吡哆醛、10.0mg 5-甲基四氫葉酸、10.0mg氰鈷胺、10.0mg甲鈷胺，分別加入10mL甲醇、10mL含1％VC甲醇，v/v、10mL甲醇、10mL甲醇，配制成濃度分別為1.0mg/mL吡哆醛母液、1.0mg/mL5-甲基四氫葉酸母液、1.0mg/mL氰鈷胺母液、1.0mg/mL甲鈷胺母液；

5.2)分別移取100μL 1.0mg/mL吡哆醛，用50％甲醇水定容至1mL得到100.0μg/mL吡哆醛中間液；移取100μL 1.0mg/mL 5-甲基四氫葉酸，用甲醇定容至1mL得到100.0μg/mL 5-甲基四氫葉酸中間液；移取10μL 1.0mg/mL甲鈷胺，用甲醇定容至1mL得到10.0μg/mL甲鈷胺中間液；

5.3)分別從上述吡哆醛中間液、5-甲基四氫葉酸中間液、氰鈷胺中間液、甲鈷胺中間液10μL、10μL、10μL、10μL，用甲醇定容至1mL，得到混合標準液A；

5.4)混合標準液A用50％甲醇稀釋得到吡哆醛/5-甲基四氫葉酸/甲鈷胺濃度分別為5/10/25/50/100/250/500/1000、5/10/25/50/100/250/500/1000、1/2/5/10/20/50/100/200ng/mL的標準曲線中間液；

5.5)吸取標準曲線中各個濃度標準曲線中間液用5％BSA/PBS，v/v，稀釋10倍，得到吡哆醛/5-甲基四氫葉酸/甲鈷胺濃度分別為0.5/1/2.5/5/10/25/50/100、0.5/1/2.5/5/10/25/50/100、0.1/0.2/0.5/1/2/5/10/20ng/mL的標準曲線；

5.6)準確移取200μL標準曲線各濃度點，加入含有3種內標的蛋白沉淀劑500μL，再加入600μL 80％正己烷/乙酸乙酯，v/v，渦旋混勻3min，于4℃，15000rpm離心10min；

5.7)取中間層500μL置于新的1.5mL EP管中，避光氮吹30min至近干，再加入溶劑溶解，渦旋混勻3min，于4℃，15000rpm離心2min；取100μL于96孔樣品板中，上機檢測；

步驟2)中使用的儀器條件為：

高效液相色譜條件：

流動相A：0.1％甲酸+純水；

流動相B：0.1％甲酸+50％乙腈甲醇；

色譜柱型號：Waters UPLC HSS PFP，2.1mm*50mm,1.7μm+在線過濾器；

柱溫：40℃±5℃；進樣量：15μL；進樣盤溫度：10℃±5℃；流速為0.3mL/min；

梯度洗脫程序如下：

時間，min	流速，mL/min	A％	B％	Curve
Initial	0.300	99.0	1.0	Initial
1.0	0.300	99.0	1.0	6
1.2	0.300	85.0	15.0	6
4.0	0.300	30.0	70.0	6
4.9	0.300	2.0	98.0	6
4.95	0.300	99.0	1.0	6
5.5	0300	99.0	1.0	6

質譜條件：

離子化模式：電噴霧正負離子切換；采用多反應監測的質譜掃描模式，毛細管電壓：3.0kV；去溶劑氣溫度：350℃；去溶劑氣流速：650L/Hr。