[發(fā)明專利]一種猴頭菌來源的UDP-葡萄糖-4-差向異構酶的表達和純化方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011336731.5
• 申請日: 2020-11-25
• 公開（公告）號: CN112322616B
• 公開（公告）日: 2022-04-05
• 發(fā)明（設計）人: 楊焱;任鄄寶;鄒根;張赫男;龔明;吳迪;張忠;陳萬超;李文;張勁松
• 申請（專利權）人: 上海市農業(yè)科學院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/70;C12N1/21;C12N9/90;C12R1/19
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 瞿曉晶

本發(fā)明涉及一種猴頭菌來源的UDP?葡萄糖?4?差向異構酶的擴增用引物、表達載體、轉化子及表達純化方法，屬于基因工程和蛋白質工程技術領域。本發(fā)明提供了一種猴頭菌來源的UDP?葡萄糖?4?差向異構酶基因的擴增用引物，所述引物包括上游引物A6180 F和下游引物A6180 R，所述A6180 F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述A6180 R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明能夠制備得到大量高純度且具備生物活性的目的蛋白。

技術領域

本發(fā)明涉及基因工程和蛋白質工程技術領域，具體涉及一種猴頭菌321菌株來源的UDP-葡萄糖-4-差向異構酶的擴增用引物、表達載體、轉化子及表達純化方法。

背景技術

UDP-葡萄糖-4差向異構酶(UDP-glucose-4-epimerase，GalE)是一種葡萄糖差向異構酶，在催化UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖之間的轉換中起著關鍵作用。為了實現(xiàn)猴頭菌321菌株來源的UDP-葡萄糖-4差向異構酶的表達，現(xiàn)有技術通常使用T4連接酶構建重組載體，但是步驟較繁瑣，容易增加實驗誤差；此外，目前只能通過實驗來驗證UDP-葡萄糖-4差向異構酶在不同菌種內的底物親和力，相對增加了研究的不確定性，現(xiàn)有技術缺乏一種在細菌中高效表達UDP-葡萄糖-4差向異構酶及純化方法。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種UDP-葡萄糖-4-差向異構酶擴增用引物、表達載體、轉化子及表達純化方法。本發(fā)明能夠制備得到大量高純度且具備生物活性的目的蛋白。

本發(fā)明提供了一種猴頭菌來源的UDP-葡萄糖-4-差向異構酶基因的擴增用引物，所述引物包括上游引物A6180 F和下游引物A6180 R，所述A6180 F的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述A6180 R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明還提供了一種猴頭菌來源的UDP-葡萄糖-4-差向異構酶基因的測序用引物，所述引物包括上游測序引物和下游測序引物，所述上游測序引物的核苷酸序列如SEQID NO.3所示，所述下游測序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本發(fā)明還提供了一種猴頭菌來源的UDP-葡萄糖-4-差向異構酶基因的重組表達載體，所述表達載體的骨架載體為去除了pelB信號肽序列的pET-22b(+)質粒。

本發(fā)明還提供了一種表達猴頭菌來源的UDP-葡萄糖-4-差向異構酶基因的轉化子，所述轉化子的宿主菌為BL21。

優(yōu)選的是，所述猴頭菌來源的UDP-葡萄糖-4-差向異構酶基因的核苷酸序列如SEQID NO.5所示。

本發(fā)明還提供了一種基于上述技術方案所述轉化子的猴頭菌來源的UDP-葡萄糖-4-差向異構酶的表達方法，包括以下步驟：將上述技術方案所述的轉化子接種于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.6～0.8，加入IPTG至濃度為1.0mM，在37℃下誘導培養(yǎng)4h，收獲菌體；將菌體與破菌液混合，超聲，離心，收集上清液，得到UDP-葡萄糖-4-差向異構酶。

優(yōu)選的是，所述破菌液包括免疫印跡及免疫沉淀用裂解液。

優(yōu)選的是，所述超聲的功率為300W，時間為30min。

本發(fā)明還提供了一種猴頭菌來源的UDP-葡萄糖-4-差向異構酶的純化方法，包括以下步驟：

用平衡緩沖液沖洗鎳柱5次，進樣，用清洗緩沖液沖洗鎳柱6次，再用洗脫緩沖液沖洗鎳柱2次，收集濾液，得到蛋白洗脫樣，將蛋白洗脫樣透析至透析緩沖液中，有沉淀產生后過濾去除沉淀并除菌，得到純化后的UDP-葡萄糖-4-差向異構酶；

所述清洗緩沖液為含20mM、50mM和80mM咪唑的pH值為7.4的PBS緩沖液，用清洗緩沖液沖洗鎳柱時，濃度從低到高，每個濃度連續(xù)洗2次。