[發明專利]一種猴頭菌來源的UDP-葡萄糖-4-差向異構酶的表達和純化方法

有效

• 申請號: 202011336731.5
• 申請日: 2020-11-25
• 公開（公告）號: CN112322616B
• 公開（公告）日: 2022-04-05
• 發明（設計）人: 楊焱;任鄄寶;鄒根;張赫男;龔明;吳迪;張忠;陳萬超;李文;張勁松
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/70;C12N1/21;C12N9/90;C12R1/19
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 瞿曉晶

1.一種基于轉化子的猴頭菌來源的UDP-葡萄糖-4-差向異構酶的表達和純化方法，包括以下步驟：

將轉化子接種于培養基中，培養至OD₆₀₀為0.6～0.8，加入IPTG至濃度為1.0mM，在37℃下誘導培養4h，收獲菌體；將菌體與破菌液混合，超聲，離心，收集上清液，得到UDP-葡萄糖-4-差向異構酶；所述超聲的功率為300W，時間為30min；

用平衡緩沖液沖洗鎳柱5次，進樣，用清洗緩沖液沖洗鎳柱6次，再用洗脫緩沖液沖洗鎳柱2次，收集濾液，得到蛋白洗脫樣，將蛋白洗脫樣透析至透析緩沖液中，有沉淀產生后過濾去除沉淀并除菌，得到純化后的UDP-葡萄糖-4-差向異構酶；

所述清洗緩沖液為含20mM、50mM和80mM咪唑的pH值為7.4的PBS緩沖液，用清洗緩沖液沖洗鎳柱時，濃度從低到高，每個濃度連續洗2次；

所述轉化子的宿主菌為BL21；所述轉化子中含有猴頭菌來源的UDP-葡萄糖-4-差向異構酶基因的重組表達載體，所述表達載體的骨架載體為去除了pelB信號肽序列的pET-22b(+)質粒；所述猴頭菌來源的UDP-葡萄糖-4-差向異構酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.根據權利要求1所述的表達和純化方法，其特征在于，所述破菌液包括免疫印跡及免疫沉淀用裂解液。

3.根據權利要求1所述的表達和純化方法，其特征在于，所述平衡緩沖液為pH值為7.4的PBS緩沖液；所述洗脫緩沖液為含500mM咪唑的pH值為7.4的PBS緩沖液；所述透析緩沖液為含300mM NaCl、10％丙三醇和1mM苯甲基磺酰氟的pH值為7.4的PBS緩沖液。