[發明專利]基因編輯提高脂肪干細胞分化效率的方法

有效

• 申請號: 202011335511.0
• 申請日: 2020-11-25
• 公開（公告）號: CN112126620B
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發明（設計）人: 張海濤;陳帥
• 申請（專利權）人: 中賽干細胞基因工程有限公司
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;C07K16/18
• 代理公司: 成都魚爪智云知識產權代理有限公司 51308
• 代理人: 趙晨宇

本發明涉及基因編輯提高脂肪干細胞分化效率的方法。本發明篩選優化得到最佳的gRNA序列后將miR?221敲除獲得了轉基因的脂肪干細胞后，針對RUNX2篩選獲得了特異性的單克隆抗體，所述單克隆抗體能夠抑制RUNX2的活性，將所述單抗加入到誘導培養基后，能夠特異性的促進脂肪干細胞分化為軟骨細胞，具有較好的誘導效率和應用價值。

技術領域

本發明涉及生物領域，具體的涉及基因編輯提高脂肪干細胞分化效率的方法。

背景技術

關節軟骨病變特別是膝關節病變的治療一直是最具挑戰性的臨床難題之一。關節軟骨屬于透明軟骨，有緩沖機械應力和保證關節的靈活運動等重要功能。但成年人的關節軟骨組織缺乏血管、神經，無淋巴回流，并且組織細胞類型單一、高度分化，軟骨細胞包埋于大量致密基質中，限制了其增殖、遷移能力。因此，組織的自愈能力有限，即使較小的軟骨損傷也可能導致骨關節炎，并發展為進行性炎癥從而導致關節退化和運動能力喪失。目前，手術治療關節軟骨損傷的方法主要包括軟骨下鉆孔、微骨折、磨削成形術、關節置換術和自體軟骨細胞移植等，但這些方法因受技術難度、組織整合差和發育形成纖維軟骨的影響存在局限性，而軟骨組織工程為解決這些難題提供了新的思路。

軟骨組織工程的主要目標是通過種子細胞、具有誘導分化能力的生物活性分子以及能為細胞生長創造適當環境的生物材料(如支架)的有效組合產生與天然軟骨生物學功能相近的新透明軟骨，實現組織結構和功能的再生。種子細胞可來源于軟骨細胞、胚胎干細胞或組織干細胞，是修復或替換受損組織的關鍵，其中成體多功能干細胞的應用不涉及倫理問題，來源相對充足且增殖修復能力較強，成為較理想的研究對象。脂肪干細胞ADSCs是軟骨組織工程中研究最為深入的MSCs類型， ADSCs的主要優點在于組織來源豐富且易獲取，ADSCs在特異性誘導因子的作用下可分化為軟骨細胞。

體外誘導ADSCs成軟骨分化所需的分化培養基通常為含有一系列生長因子的混合物。其中，轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)是ADSCs成軟骨分化培養基中最重要的組分，其在哺乳動物體內有3種亞型：TGF-β1，-β2和-β3。TGF-β通過與ADSCs表面受體結合，使I型受體即激活素受體激酶-5(activin receptor-like kinase-5，ALK-5)磷酸化，進而激活Smad通路，啟動軟骨特異性基因的轉錄。TGF-β1具有雙相作用：在100pg/mL-1 ng/mL的濃度范圍內增強內皮細胞的增殖和侵襲效應，在5-10 ng/mL范圍內抑制內皮細胞侵襲和毛細血管形成，誘導ADSCs的成軟骨分化。TGF-β的3種亞型對ADSCs都有一定的成軟骨誘導效應，但3種亞型誘導效應的不同之處暫無定論，目前研究表明對ADSCs而言TGF-β1與TGF-β3的誘導效應并無顯著差異。

因應用外源性生長因子效率低、半衰期短，有學者提出了一種長期穩定的誘導方式，即利用基因轉染上述生長因子的目的基因得到內源性生長因子，通過分泌途徑發揮作用。盡管基因操作可控制特定生長因子的分泌，但由于軟骨形成是由多種生長因子和其他信號分子協調操控的，所以一次只能靶向一種基因限制了基因轉染的應用潛力，但是目前研究還不夠多，還有很大的改進空間。

發明內容

本發明克服現有技術的缺陷，提供一種改進的誘導干細胞成為軟骨細胞的方法。

具體的，發明人發現在脂肪干細胞中，通過將miR-221敲除以及抑制RUNX2的活性，能夠特異性的促進脂肪干細胞分化為軟骨細胞。

一方面，本發明提供一種基因編輯修飾的脂肪干細胞。

所述修飾為將脂肪干細胞的miR-221進行敲除。

具體的，根據miR221的前體序列，設計了多組gRNA序列，其中篩選獲得最優的g4-RNA作為實驗序列。具體的gRNA序列如SEQ ID NO：1所示, gRNA4:TGTAGATTTCTGTGTTCGTTAGG。