[發明專利]一種有活性的落葉松啟動子、獲取及鑒定方法

有效

• 申請號: 202011332993.4
• 申請日: 2020-11-24
• 公開（公告）號: CN112553197B
• 公開（公告）日: 2022-06-14
• 發明（設計）人: 張韜;劉鵬;劉冠卿
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/10;C12N15/82;C12N15/65;C12Q1/6897
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 柏尚春

本發明公開了一種有活性的落葉松啟動子、獲取及鑒定方法。啟動子DNA序列如SEQ ID NO.1。用特異引物以日本落葉松的基因組DNA為模板，擴增得到430bp的擴增產物，即得。將這一段DNA分子驅動GFP熒光蛋白基因表達，可觀察到熒光信號，證實該序列為啟動子。本發明提供的落葉松啟動子序列，本質是DNA分子，430bp，能夠啟動轉錄。

技術領域

本發明涉及生物技術，特別涉及一種有活性的落葉松啟動子、獲取及鑒定方法。

背景技術

落葉松是松科落葉松屬的一類重要的喬木類植物，在全球包含20多個種類。由于落葉松喜光、耐寒、適應性強等特征。落葉松早期生長快，抗逆抗病性強，此外，其木材強度大，耐腐蝕，可作為多種行業的優良建材。落葉松還是重要的園林觀賞植物。

大多數啟動子位于基因5’端轉錄起始位點上游，能夠被轉錄因子特異性識別和結合，進而招募RNA聚合酶，形成轉錄起始復合物，啟動其目標基因表達。落葉松基因組較大，對其基因組信息了解的并不深入。鑒定有活性落葉松啟動子對于其基因調控網絡的認識有重要促進作用。

發明內容

發明目的：本發明目的是提供有活性的落葉松啟動子。

本發明另一目的是提供所述有活性的落葉松啟動子的獲取方法及鑒定方法。

技術方案：本發明提供一種有活性的落葉松啟動子，DNA序列如SEQ ID NO.1。

所述的有活性的落葉松啟動子的獲取方法，包括如下步驟：用特異引物以日本落葉松的基因組DNA為模板，擴增得到430bp的擴增產物，即得。

進一步地，所述特異引物序列如下：

正向：5’-gagtgtcgtgctccaccatggatttgtatttttccagtct-3’；

反向：5’-ctcttcttcttaggagccatcacgtcacaaatccattatt-3’。

進一步地，落葉松RNA-seq：將落葉松針葉和誘導培養的落葉松愈傷組織分別進行轉錄組測序，利用無參考基因組方法拼裝轉錄本，之后結合蛋白質數據庫，對表達轉錄本進行注釋；ATAC-seq：將誘導培養的落葉松愈傷組織進行ATAC-seq測序，獲得基因組開放染色質序列，進一步預測潛在調控元件；整合測序數據，通過拼裝獲得落葉松序列SEQ ID NO.2，該序列中包括一個轉錄本，啟動子位于基因的轉錄起始位點(TSS)上游，活性的啟動子位于開放染色質，能激活下游基因的表達，將其轉錄本TSS上游1kb具有開放染色質的序列擴增(引物同上)，最終獲得序列SEQ ID NO.1。

所述的有活性的落葉松啟動子的鑒定方法，包括如下步驟：

(1)將啟動子DNA序列SEQ ID NO.1插入GFP熒光蛋白報告基因載體，構建LkPro1reporter載體；

(2)正對照載體采用CaMV35S-GFP reporter；

(3)落葉松原生質體的制備與轉化；

(4)轉化后對啟動子活性進行熒光驗證。

所述的有活性的落葉松啟動子的鑒定方法，其特征在于：所述LkPro1reporter載體的構建方法：使用限制性內切酶AscI和XbaI將GFP熒光蛋白報告基因載體線性化，后用無縫連接試劑盒將其與啟動子序列片段連接，轉化至大腸桿菌DH5α中，篩選陽性轉化子，得到載體LkPro1reporter。

鑒定原理：將一段有啟動子活性的DNA分子驅動GFP熒光蛋白基因表達，可觀察到熒光信號，證實該序列為啟動子。

有益效果：本發明提供了落葉松啟動子序列，本質是DNA分子，430bp，能夠啟動轉錄，同時提供了快捷的鑒定方法。

附圖說明