[發明專利]一種有活性的落葉松啟動子、獲取及鑒定方法

有效

• 申請號: 202011332993.4
• 申請日: 2020-11-24
• 公開（公告）號: CN112553197B
• 公開（公告）日: 2022-06-14
• 發明（設計）人: 張韜;劉鵬;劉冠卿
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/10;C12N15/82;C12N15/65;C12Q1/6897
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 柏尚春

1.一種有活性的落葉松啟動子，DNA序列如SEQ ID NO.1。

2.權利要求1所述的有活性的落葉松啟動子的獲取方法，其特征在于：包括如下步驟：用特異引物以日本落葉松的基因組DNA為模板，擴增得到430bp的擴增產物，即得有活性的落葉松啟動子。

3.根據權利要求2所述的有活性的落葉松啟動子的獲取方法，其特征在于：所述特異引物序列如下：

正向：5'-gagtgtcgtgctccaccatggatttgtatttttccagtct-3’；

反向：5’-ctcttcttcttaggagccatcacgtcacaaatccattatt-3’。

4.權利要求1所述的有活性的落葉松啟動子的獲取方法，其特征在于：落葉松RNA-seq：將落葉松針葉和誘導培養的落葉松愈傷組織分別進行轉錄組測序，利用無參考基因組方法拼裝轉錄本，之后結合蛋白質數據庫，對表達轉錄本進行注釋；ATAC-seq：將誘導培養的落葉松愈傷組織進行ATAC-seq測序，獲得基因組開放染色質序列，進一步預測潛在調控元件，整合測序數據，通過拼裝獲得落葉松序列SEQ ID NO.2，該序列中包括一個轉錄本，啟動子位于基因的轉錄起始位點(TSS)上游，活性的啟動子位于開放染色質，能激活下游基因的表達，將其轉錄本TSS上游1kb具有開放染色質的序列擴增，最終獲得序列SEQ ID NO.1。

5.權利要求1所述的有活性的落葉松啟動子的鑒定方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)將啟動子DNA序列SEQ ID NO.1插入GFP熒光蛋白報告基因載體，構建LkProlreporter載體；

(2)正對照載體采用CaMV35S-GFP reporter；

(3)落葉松原生質體的制備與轉化；

(4)轉化后對啟動子活性進行熒光驗證。

6.根據權利要求5所述的有活性的落葉松啟動子的鑒定方法，其特征在于：所述LkProlreporter載體的構建方法：使用限制性內切酶AscI和XbaI將GFP GFP熒光蛋白報告基因載體線性化，后用無縫連接試劑盒將其與啟動子序列片段連接，轉化至大腸桿菌DH5α中，篩選陽性轉化子，得到載體LkProlreporter。