[發明專利]一種復雜樣品中細菌的快速檢測方法

有效

• 申請號: 202011332431.X
• 申請日: 2020-11-24
• 公開（公告）號: CN112410405B
• 公開（公告）日: 2022-03-25
• 發明（設計）人: 林星宇;羅自生;李莉
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/689;C12Q1/06;C12Q1/10;C12R1/01;C12R1/19;C12R1/42
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 韓聰

本發明公開了一種復雜樣品中細菌的快速檢測方法，屬于分子生物學技術領域。所述方法包括：(1)將待測樣品加入到含有溶菌酶的環介導等溫擴增反應體系溶液中，再往反應體系中加入水凝膠單體，室溫下形成水凝膠；(2)將水凝膠體系置于恒溫條件下進行等溫擴增反應；(3)利用熒光成像技術分析等溫擴增反應后的水凝膠體系中的熒光信號，計算出待測樣品中的目標細菌濃度。本發明將LAMP反應體系從以往的溶液態創新性地轉變為水凝膠態，進行LAMP原位擴增，水凝膠中的眾多納米孔洞可以起到隔離有機質、重金屬等抑制劑的作用，從而實現細菌的絕對定量分析，為真實復雜樣品中細菌檢測提供了一種價格低廉，操作靈活簡潔的數字核酸檢測技術。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，具體涉及一種基于納米多孔水凝膠體系的環介導等溫擴增方法快速檢測復雜樣品中的細菌。

背景技術

傳統的致病菌檢測通過細菌培養來實現定量測定，但它們的操作時間過長并且在識別某些物種方面存在局限性。核酸擴增反應可以將檢測時間縮短到幾個小時，如環介導等溫擴增反應(LAMP)，是一種新型的等溫核酸擴增方法，其特點是針對靶基因的6-8個區域設計4-6種特異引物，在鏈置換DNA聚合酶的作用下，65℃恒溫擴增并可在60分鐘左右實現10⁹倍的核酸擴增，該方法具有操作簡單、特異性強、產物易檢測等特點。與此同時，反應析出大量的白色焦磷酸鎂沉淀，利用這個特點，實驗人員可以通過觀察反應體系的渾濁程度或者熒光強度來判斷結果是陰性還是陽性。基于以上特點，LAMP在細菌檢測等方面有著廣泛的應用前景。

但是當LAMP直接被用來檢測真實復雜樣品時，擴增反應容易被真實復雜樣品中的有機質、重金屬等抑制劑所抑制，造成反應結果假陰性且無法成功檢測。現有的核酸擴增技術擴增前通常需要耗時費力的樣品預處理步驟，例如DNA提取和純化，特別是未經處理的真實復雜樣品。另外，核酸擴增技術擴增需要昂貴的儀器來進行實時熒光測量，難以進行細菌數目的絕對定量分析，并且不適用于低成本的現場操作和精確的定量分析。

公布號為CN111549147A的中國發明專利申請文件公開了一種細菌快速檢測方法及試劑，以細菌的16S rRNA或其PCR擴增產物作為測定靶標，設計捕獲探針和檢測探針；將附著有16S rRNA或其PCR擴增產物的捕獲探針的微球、檢測探針以及經細胞裂解處理的待測樣品混合；檢測復合物中不同微球的微球識別信號以及可檢測標記物，從而確定待測樣品中各待測細菌的存在與否以及存在的量，使檢測變得更快、更簡便、更合理，成本低廉，檢測效果良好。但是該非數字化檢測方法只能作為一種簡單的判定手段，無法進行準確定量檢測，且無法對未經過預處理的真實復雜樣品進行直接快速檢測。

近年來，數字核酸檢測技術發展迅速，該技術通過將單個細菌核酸分子分隔在單個隔室中并進行獨立的核酸擴增反應以鑒定目標核酸的絕對準確濃度。更高的特異性和準確度，更好的變異分析能力以及終點檢測和絕對定量等性能使數字化擴增技術在各種檢測中得以擴展。

現有的基于微流控芯片陣列反應室的數字化環介導等溫擴增方法(digitalLAMP)的設計和使用成本相對較高，可擴展性有限，更重要的是微流控裝置加工過程過于繁瑣，而且價格昂貴，難以一次性使用，且該方法也有低亮暗比、容易受抑制劑影響等缺點。因此，迫切需要開展一種具有技術穩定，操作簡單靈活，成本低廉的數字量化檢測方法來快速檢測真實復雜樣品中的細菌。

發明內容

本發明的目的是提供一種能夠對真實復雜樣品如全血、奶茶等中的細菌進行直接快速檢測的方法，克服復雜樣品中有機質、重金屬等抑制劑的作用，實現細菌的絕對定量分析。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種復雜樣品中細菌的快速檢測方法，所述復雜樣品為含有有機質或金屬離子的混合物，所述檢測方法包括以下步驟：

(1)將待測樣品加入到含有溶菌酶的環介導等溫擴增反應體系溶液中，再往反應體系中加入水凝膠單體，室溫下形成水凝膠；所述環介導等溫擴增反應體系包括特異性擴增目標細菌DNA的引物；