[發明專利]一種復雜樣品中細菌的快速檢測方法

有效

• 申請號: 202011332431.X
• 申請日: 2020-11-24
• 公開（公告）號: CN112410405B
• 公開（公告）日: 2022-03-25
• 發明（設計）人: 林星宇;羅自生;李莉
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/689;C12Q1/06;C12Q1/10;C12R1/01;C12R1/19;C12R1/42
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 韓聰

1.一種復雜樣品中細菌的快速檢測方法，其特征在于，所述復雜樣品為全血或奶茶，所述檢測方法包括以下步驟：

(1)將待測樣品加入到環介導等溫擴增反應體系溶液中，所述待測樣品無需預處理，所述的環介導等溫擴增反應體系包括：1×LAMP buffer，6mM MgSO₄，1.4mM dNTP，640U/mLBst 2.0DNA聚合酶，特異性擴增目標細菌DNA的引物混合物，1.0mg/mL BSA，0.1mg/mL溶菌酶和熒光染料，再往反應體系中加入水凝膠單體，所述水凝膠單體包括分子量為10000MW的四臂乙二醇丙烯酸酯和分子量為3400MW的巰基-聚乙二醇-巰基，摩爾比為1:2，四臂乙二醇丙烯酸酯以質量體積比10％添加至反應體系中，室溫下形成水凝膠；

(2)將水凝膠體系置于60～70℃恒溫加熱10～60min進行等溫擴增反應；

(3)利用熒光成像技術分析等溫擴增反應后的水凝膠體系中的熒光信號，計算出待測樣品中的目標細菌濃度；

所述檢測方法為非診斷方法。

2.如權利要求1所述的復雜樣品中細菌的快速檢測方法，其特征在于，所述引物混合物為1.6μM FIP和BIP，0.2μM F3和B3與0.8μM LF和LB的混合物。

3.如權利要求1所述的復雜樣品中細菌的快速檢測方法，其特征在于，所述熒光染料為Eva Green、STBR Green、Syto 9和SYTOX Orange中的任意一種。

4.如權利要求1所述的復雜樣品中細菌的快速檢測方法，其特征在于，步驟(2)中，水凝膠體系置于防止水分蒸發的密封空間內進行等溫擴增反應。

5.如權利要求1所述的復雜樣品中細菌的快速檢測方法，其特征在于，步驟(3)中，利用Image J軟件對水凝膠體系的熒光圖像進行計數分析。

6.如權利要求1所述的復雜樣品中細菌的快速檢測方法，其特征在于，步驟(3)中，利用發藍光或紫色的LED手電筒照射水凝膠系統進行計數分析。