[發明專利]一種檢測冠狀病毒的反義RNA探針及其制備方法、檢測冠狀病毒的試劑盒與方法

在審

• 申請號: 202011331990.9
• 申請日: 2020-11-24
• 公開（公告）號: CN112266985A
• 公開（公告）日: 2021-01-26
• 發明（設計）人: 謝東陽
• 申請（專利權）人: 謝東陽
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6806;C12Q1/6804;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 王志新

本發明公開了一種檢測冠狀病毒的反義RNA探針及其制備方法、檢測冠狀病毒的試劑盒與方法，屬于核酸雜交技術領域。本發明為了提高冠狀病毒檢測的準確性和特異性，本發明提供的檢測冠狀病毒的方法是將待測樣本與蛋白酶K混合經過漂洗，加入預雜交液孵育，加入地高辛修飾的反義RNA探針孵育后與阻斷溶液混合，加入地高辛修飾的抗體，然后與含有羔羊血清的MABT溶液混合，加入AP底物染色緩沖液進行室溫避光孵育，用顯微鏡觀察和照相得到檢測冠狀病毒的結果。該方法檢測樣本量少無需提取細胞中的RNA，可以有效避免熒光定量PCR檢測中RNA損失而導致假陰性結果的問題，靈敏度高，提高了檢測結果的準確性。

技術領域

本發明屬于核酸雜交技術領域，具體涉及一種檢測冠狀病毒的反義RNA探針及其制備方法、檢測冠狀病毒的試劑盒與方法。

背景技術

2019新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)，其潛伏期長、侵染力強，主要攻擊動物體的肺部，引起肺部感染。

目前鑒定新型冠狀病毒有熒光定量PCR法和抗體檢測方法，其中核酸檢測方法為檢驗病毒方法的金標準，但是現有方法中仍存在諸多問題，諸如：

(1)熒光定量PCR能夠鑒定疑似患者體內的核酸，該方法需要提取細胞中的RNA，隨后進行反轉錄，然后進行PCR鑒定，在這些實驗操作中RNA的損失比較多，如果疑似患者處于感染早期或者體內本身含有病毒量比較少，很容易導致RNA在提取過程中丟失，導致假陰性結果出現。

(2)由于新型冠狀病毒是RNA病毒，RNA病毒變異速度快，并且該變異能夠不斷進行累積，熒光定量PCR實驗對核酸序列要求比較高，尤其是在PCR引物覆蓋的區域要求比較苛刻，如果該區域核酸發生突變，導致PCR擴增效率降低甚至不能擴增出來，從而產生假陰性結果。

(3)熒光定量PCR實驗未經過測序鑒定，有可能擴增出非目的片段，出現假陽性現象，造成了檢測結果的不準確。

因此，如何提供一種可以有效檢測SARS-CoV-2的探針，并將其應用于檢測SARS-CoV-2中是本領域技術人員亟需解決的問題。

發明內容

本發明的目的是為了提高SARS-CoV-2冠狀病毒檢測的準確性和特異性，為了解決檢測SARS-CoV-2冠狀病毒的準確性不高的問題，本發明提供了一種檢測冠狀病毒的反義RNA探針，所述反義RNA探針的序列如SEQ ID NO.4所示。

本發明還提供了上述反義RNA探針的制備方法具體步驟如下：

(1)設計引物：

COVID-19-F1序列為5'-GATCAAAACAACGTCGGCCC-3'；COVID-19-R1序列為5'-GCGTAATACGACTCACTATAGGGTTCTGTCTCTGCGGTAAGGC-3'；

(2)構建重組載體：將冠狀病毒SARS-CoV-2待測區域堿基序列如SEQ ID NO.1所示插入到質粒pcDNA3.1-myc-HisA中BamHI和XbaI之間，得到重組載體pcDNA3.1-myc-HisA-COVID-19；

(3)PCR擴增冠狀病毒SARS-CoV-2待測區DNA序列：以步驟(2)得到的重組載體為模板，以步驟(1)的引物，利用PCR技術擴增序列，得到冠狀病毒SARS-CoV-2待測區DNA序列；

(4)體外轉錄得到反義RNA探針：以步驟(3)得到的冠狀病毒SARS-CoV-2待測區DNA片段為模板進行體外轉錄，得到反義RNA探針。

本發明還提供了一種檢測冠狀病毒試劑盒，所述試劑盒包括地高辛修飾的上述反義RNA探針。