[發明專利]一種檢測冠狀病毒的反義RNA探針及其制備方法、檢測冠狀病毒的試劑盒與方法

在審

• 申請號: 202011331990.9
• 申請日: 2020-11-24
• 公開（公告）號: CN112266985A
• 公開（公告）日: 2021-01-26
• 發明（設計）人: 謝東陽
• 申請（專利權）人: 謝東陽
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6806;C12Q1/6804;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 王志新

1.一種檢測冠狀病毒的反義RNA探針，其特征在于，所述反義RNA探針的序列如SEQ IDNO.4所示。

2.如權利要求1所述的RNA探針的制備方法，其特征在于，所述制備方法的具體步驟如下：

(1)設計引物：COVID-19-F1序列為5'-GATCAAAACAACGTCGGCCC-3'；COVID-19-R1序列為5'-GCGTAATACGACTCACTATAGGGTTCTGTCTCTGCGGTAAGGC-3'；

(2)構建重組載體：將冠狀病毒SARS-CoV-2待測區域堿基序列如SEQ ID NO.1所示插入到質粒pcDNA3.1-myc-HisA中BamHI和XbaI之間，得到重組載體pcDNA3.1-myc-HisA-COVID-19；

(3)PCR擴增冠狀病毒SARS-CoV-2待測區DNA序列：以步驟(2)得到的重組載體為模板，以步驟(1)的引物，利用PCR技術擴增序列，得到冠狀病毒SARS-CoV-2待測區DNA序列；

(4)體外轉錄得到反義RNA探針：以步驟(3)得到的冠狀病毒SARS-CoV-2待測區DNA片段為模板進行體外轉錄，得到反義RNA探針。

3.一種檢測冠狀病毒的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括地高辛修飾的權利要求1所述的反義RNA探針。

4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括：預雜交液、阻斷溶液、AP底物染色緩沖液、MABT溶液、50％甲酰胺/2×SSCT緩沖液、2×SSCT緩沖液、0.2×SSCT緩沖液、檢測緩沖液、冠狀病毒SARS-CoV-2陰性對照和冠狀病毒SARS-CoV-2陽性對照。

5.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述地高辛修飾的反義RNA探針的濃度為2ng/μL。

6.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述預雜交液包括體積比50％甲酰胺、5×SSCT、50μg/mL肝素、5mM EDTA、0.05mg/mL核糖體RNA、1M檸檬酸和0.1％Tween；所述阻斷溶液包括1％羊血清、2％阻斷劑、100mM順丁烯二酸和150mMNaCl；所述AP底物染色緩沖液包括氯化硝基四氮唑藍、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽和左旋咪唑；所述MABT溶液包括順丁烯二酸和NaCl；所述檢測緩沖液包括100mMNaCl、50mM MgCl₂、100mM三羥甲基氨基甲烷、體積分數為0.1％的Tween-20和1mM左旋咪唑。

7.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述冠狀病毒SARS-CoV-2陽性對照是1×10⁵個帶有冠狀病毒SARS-CoV-2的Hek293細胞；所述冠狀病毒SARS-CoV-2陰性對照是1×10⁵個不攜帶冠狀病毒SARS-CoV-2的Hek293細胞。