[發明專利]一種利用基因編輯技術選育高類胡蘿卜素油菜種子的方法

有效

• 申請號: 202011331971.6
• 申請日: 2020-11-24
• 公開（公告）號: CN112391408B
• 公開（公告）日: 2022-12-23
• 發明（設計）人: 劉超;王芳;范楚川;張椿雨;李安安;張鴻遠
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/10;A01H6/20
• 代理公司: 北京興智翔達知識產權代理有限公司 11768
• 代理人: 張玉梅

本發明屬于農作物分子育種技術領域，具體涉及一種利用基因編輯技術選育高類胡蘿卜素油菜種子的方法，獲得的高類胡蘿卜素油菜種質資源可用于油菜的品質育種。本發明所述利用基因編輯技術獲得高類胡蘿卜素油菜種子的方法，利用基因編輯技術突變甘藍型油菜的BnaCCD4的三個拷貝BnaA1CCD4、BnaC1CCD4和BnaA8CCD4，構建用于甘藍型油菜三個拷貝定向編輯的重組載體pBnaCCD4，并利用農桿菌介導的遺傳轉化方法轉化甘藍型油菜，獲得種子中類胡蘿卜素含量顯著提高的株系。本發明所述方法可以顯著提高油菜種子中類胡蘿卜素的含量，尤其是β?胡蘿卜素的含量，為油菜品質改良提供新的種質資源，并拓寬了甘藍型油菜品質育種的方向，具備良好的應用前景。

技術領域

本發明屬于農作物分子育種技術領域，具體涉及一種利用基因編輯技術選育高類胡蘿卜素油菜種子的方法，獲得的高類胡蘿卜素油菜種質資源可用于油菜的品質育種。

背景技術

油菜，是十字花科植物，屬蕓薹屬不同種，營養價值豐富，尤其維生素C含量很高。目前油菜主要栽培類型為：白菜型油菜、芥菜型油菜和甘藍型油菜。油菜是世界上最重要的油料作物之一，是人類食用油的重要來源。

傳統的油菜品質改良主要集中在含油量、脂肪酸、蛋白質和硫苷含量等方面。除此之外，油菜籽中還含有多種對人體健康重要的活性功能成份，如類胡蘿卜素、甾醇和維生素E等(王漢中，2018)。其中，類胡蘿卜素是人體健康必需的維生素A的合成前體，對人體免疫系統具有很好的保護作用。由于類胡蘿卜素為脂溶性物質，當單純攝入主糧作物中的類胡蘿卜素時，人體的吸收率較低，而油脂則能夠顯著促進人體對類胡蘿卜素的吸收效率，因此提高油料作物中的類胡蘿卜素含量，可以有效提升人體對類胡蘿卜素的攝取量。然而，目前在已知的油菜種質中，種子中類胡蘿卜素的水平普遍較低。因此，開發培育高類胡蘿卜素含量的油菜品種成為油菜品質育種的重要方向。

據報道，類胡蘿卜素裂解雙加氧酶(carotenoid cleavage dioxygenases4，CCD4)是植物體內類胡蘿卜素降解途徑中的關鍵基因。在先研究也表明，在模式植物擬南芥中存在一個AtCCD4基因，而在甘藍型油菜中共存在四個CCD4同源基因，其中，BnaC3.CCD4基因在花器官中進行特異表達，其它三個基因BnaA1.CCD4、BnaA8.CCD4和BnaC1.CCD4 則主要在葉片和種子中進行表達(Zhang et al,2015)。因此，擬南芥種子中AtCCD4及甘藍型油菜花中BnaC3.CCD4的功能缺失，都能夠顯著提高相應組織中類胡蘿卜素的含量(Gonzalez-Jorgeet al,2013；Zhang et al, 2015)。但是，目前尚未見基于甘藍型油菜種子中BnaCCD4功能缺失提高種子中類胡蘿卜素含量的報道。

發明內容

為此，本發明所要解決的技術問題在于提供一種利用CRISPR/Cas9基因編輯技術對甘藍型油菜BnaCCD4三個拷貝進行基因編輯，從而獲得高類胡蘿卜素含量的甘藍型油菜種質的方法。

為解決上述技術問題，本發明所述的一種利用基因編輯技術選育高類胡蘿卜素油菜種子的方法，包括如下步驟：

(1)在甘藍型油菜BnaCCD4核苷酸序列相似程度高的位置篩選靶點序列，并設計相對應的靶點引物；

(2)利用所述靶點引物，構建用于所述甘藍型油菜定向編輯的 CRISPR/Cas9重組載體pBnaCCD4；

(3)將所述pBnaCCD4載體轉化甘藍型油菜，進而獲得種子中類胡蘿卜素含量顯著提高的株系。

具體的，所述步驟(1)中，所述BnaCCD4包括BnaA1CCD4、BnaC1CCD4、 BnaA8CCD4三個拷貝基因，其核苷酸序列分別如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示。