[發明專利]一種利用基因編輯技術選育高類胡蘿卜素油菜種子的方法

有效

• 申請號: 202011331971.6
• 申請日: 2020-11-24
• 公開（公告）號: CN112391408B
• 公開（公告）日: 2022-12-23
• 發明（設計）人: 劉超;王芳;范楚川;張椿雨;李安安;張鴻遠
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/10;A01H6/20
• 代理公司: 北京興智翔達知識產權代理有限公司 11768
• 代理人: 張玉梅

1.一種利用基因編輯技術選育高類胡蘿卜素油菜種子的方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）在甘藍型油菜BnaCCD4核苷酸序列相似程度高的位置篩選靶點序列，并設計相對應的靶點引物；

所述BnaCCD4包括BnaA1CCD4、BnaC1CCD4、BnaA8CCD4三個拷貝基因，其核苷酸序列分別如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示；

經篩選的所述靶點序列包括S1、S2、S3、S4和S5，其核苷酸序列分別如SEQ ID No.4、SEQID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示；

設計的所述靶點引物包括：

對應于所述靶點S1的靶點引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示；

對應于所述靶點S2的靶點引物的核苷酸序列如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示；

對應于所述靶點S3的靶點引物的核苷酸序列如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示；

對應于所述靶點S4的靶點引物的核苷酸序列如SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示；

對應于所述靶點S5的靶點引物的核苷酸序列如SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示；

（2）利用所述靶點引物，構建用于甘藍型油菜定向編輯的CRISPR/Cas9重組載體pBnaCCD4；

（3）將所述pBnaCCD4載體轉化甘藍型油菜，進而獲得種子中類胡蘿卜素含量顯著提高的株系。

2.根據權利要求1所述的利用基因編輯技術選育高類胡蘿卜素油菜種子的方法，其特征在于，所述步驟（2）中，所述CRISPR/Cas9重組載體pBnaCCD4的構建步驟包括：將設計的所述靶點引物與sgRNA靶標表達盒連接的步驟，對不同sgRNA靶標表達盒進行擴增的步驟，以及將所述sgRNA靶標表達盒與基因編輯載體pYLCRISPR/Cas9順次連接的步驟。

3.根據權利要求1或2所述的利用基因編輯技術選育高類胡蘿卜素油菜種子的方法，其特征在于，所述步驟（3）中，所述轉化甘藍型油菜的步驟為利用農桿菌介導的遺傳轉化方法進行轉化。

4.權利要求1-3任一項所述利用基因編輯技術選育高類胡蘿卜素含量的油菜種子的方法在油菜育種領域中的應用。