[發(fā)明專利]一種在谷氨酸棒狀桿菌中利用木糖生成谷氨酸的合成路徑的構(gòu)建方法

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• 申請日: 2020-11-24
• 公開（公告）號: CN112458108A
• 公開（公告）日: 2021-03-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鮑杰;金慈
• 申請（專利權(quán)）人: 華東理工大學(xué)
• 主分類號: C12N15/77
• 分類號: C12N15/77;C12N15/90;C12N15/61;C12N15/54;C12N15/53;C12N15/31;C12N1/21;C12P13/18;C12P13/14;C12R1/15
• 代理公司: 上海三和萬國知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31230
• 代理人: 任艷霞

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，公開一種在谷氨酸棒狀桿菌中利用木糖生成谷氨酸的合成路徑的構(gòu)建方法：(1)在谷氨酸棒狀桿菌中表達(dá)異源的戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；(2)在谷氨酸棒狀桿菌中表達(dá)異源的木糖異構(gòu)酶和木酮糖激酶；(3)生成的5?磷酸木酮糖通過磷酸戊糖途徑和糖酵解途徑可以生成α?酮戊二酸，將α?酮戊二酸脫氫酶進(jìn)行弱化表達(dá)，使α?酮戊二酸更多的流向谷氨酸的合成；(4)對谷氨酸分泌蛋白進(jìn)行修飾，使谷氨酸棒狀桿菌不再響應(yīng)外界生物素壓力，持續(xù)將谷氨酸分泌到胞外。本發(fā)明構(gòu)建的木糖到谷氨酸的合成路徑，使谷氨酸棒狀桿菌可以在常規(guī)的合成培養(yǎng)基利用木糖生產(chǎn)谷氨酸，在木質(zhì)纖維素等高生物素的環(huán)境中也可以進(jìn)行木糖到谷氨酸的合成。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種在谷氨酸棒狀桿菌中利用木糖生成谷氨酸的合成路徑的構(gòu)建方法及構(gòu)建可以在高生物素環(huán)境中利用木糖生產(chǎn)谷氨酸的工程菌株和其應(yīng)用。

背景技術(shù)

谷氨酸是一種重要的工業(yè)化氨基酸，被廣泛的用于食品和飼料等領(lǐng)域，同時(shí)也被當(dāng)做單體用于生產(chǎn)聚谷氨酸等生物聚合材料。在2013年，谷氨酸的年產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到300萬噸，說明其需求量十分巨大。目前主要是通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酸，但是這種方法所用的原料多是淀粉等糧食類作物，這就造成了“與人爭糧”的問題。因此尋求更加廉價(jià)、來源廣泛的原料成為當(dāng)務(wù)之急。木質(zhì)纖維素的來源廣泛，供應(yīng)量大，價(jià)格低廉，是作為谷氨酸發(fā)酵原料的最佳選擇。

木質(zhì)纖維素主要有纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成。其中纖維素中富含的大量葡萄糖可以被多數(shù)微生物所利用，但是半纖維素來源的木糖也占到木質(zhì)纖維素總糖的30％，利用這些木糖進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，是高效利用木質(zhì)纖維素的前提。

谷氨酸棒狀桿菌具有廣泛的底物生產(chǎn)潛力，被用于合成各種氨基酸，有機(jī)酸和生物燃料等生物基化學(xué)品。但是野生的谷氨酸棒狀桿菌不能利用木糖，因此通過代謝工程改造使其能夠利用木質(zhì)纖維素中的木糖是其進(jìn)行木質(zhì)纖維素發(fā)酵的前提條件。同時(shí)木質(zhì)纖維素中含有大量的生物素，而這些生物素會促進(jìn)谷氨酸棒狀桿菌細(xì)胞壁的合成，從而抑制谷氨酸的分泌，因此解決谷氨酸棒狀桿菌在高生物素環(huán)境中分泌谷氨酸的問題也是必要步驟。

目前還沒有對谷氨酸棒狀桿菌進(jìn)行木糖路徑構(gòu)建以共利用木質(zhì)纖維素中的葡萄糖和木糖生產(chǎn)谷氨酸的報(bào)道，因此建立一種共發(fā)酵麥稈水解液中的葡萄糖和木糖生產(chǎn)谷氨酸的谷氨酸棒狀桿菌構(gòu)建方法，對于木質(zhì)纖維素谷氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)是非常有必要的。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種在谷氨酸棒狀桿菌中利用木糖生成谷氨酸的合成路徑的構(gòu)建方法。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于構(gòu)建一株可以在高生物素環(huán)境中利用木糖生產(chǎn)谷氨酸的工程菌株。

本發(fā)明出發(fā)菌株為谷氨酸棒狀桿菌Corynebacterium glutamicumS9114，購買自上海工業(yè)微生物所中(SIIM,Shanghai,China,http://www.gsysiim.com/)，保藏編號為SIIM B460，該菌株同時(shí)還保藏在中國工業(yè)微生物菌株保藏管理中心(China Center ofIndustrial Culture Collection,CICC,http://www.china-cicc,org/)，保藏編號為CICC20935。改造菌株還未進(jìn)行保藏)

本發(fā)明實(shí)現(xiàn)谷氨酸棒狀桿菌中木糖到谷氨酸合成路徑構(gòu)建所采用的技術(shù)方案是：首先在谷氨酸棒狀桿菌中表達(dá)異源的戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，幫助谷氨酸棒狀桿菌將木糖吸收至胞內(nèi)；然后在谷氨酸棒狀桿菌中表達(dá)異源的木糖異構(gòu)酶和木酮糖激酶，將木糖異構(gòu)為木酮糖，再磷酸化為5-磷酸木酮糖；生成的5-磷酸木酮糖通過谷氨酸棒狀桿菌本身具有的磷酸戊糖途徑和糖酵解途徑可以生成α-酮戊二酸，對α-酮戊二酸脫氫酶進(jìn)行弱化表達(dá)，使α-酮戊二酸更多的流向谷氨酸的合成；最后對谷氨酸分泌蛋白進(jìn)行修飾，使谷氨酸棒狀桿菌不再響應(yīng)外界生物素壓力，持續(xù)將谷氨酸分泌到胞外。