[發(fā)明專(zhuān)利]一種在谷氨酸棒狀桿菌中利用木糖生成谷氨酸的合成路徑的構(gòu)建方法在審
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 202011331840.8 | 申請(qǐng)日： | 2020-11-24 |
| 公開(kāi)（公告）號(hào)： | CN112458108A | 公開(kāi)（公告）日： | 2021-03-09 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 鮑杰;金慈 | 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人： | 華東理工大學(xué) |
| 主分類(lèi)號(hào)： | C12N15/77 | 分類(lèi)號(hào)： | C12N15/77;C12N15/90;C12N15/61;C12N15/54;C12N15/53;C12N15/31;C12N1/21;C12P13/18;C12P13/14;C12R1/15 |
| 代理公司： | 上海三和萬(wàn)國(guó)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31230 | 代理人： | 任艷霞 |
| 地址： | 200237 *** | 國(guó)省代碼： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 谷氨酸 桿菌 利用 生成 合成 路徑 構(gòu)建 方法 | ||
1.一種在谷氨酸棒狀桿菌中利用木糖生成谷氨酸的合成路徑的構(gòu)建方法，其特征是包括如下步驟：
(1)在谷氨酸棒狀桿菌中表達(dá)異源的戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，幫助谷氨酸棒狀桿菌將木糖吸收至胞內(nèi)；
(2)在谷氨酸棒狀桿菌中表達(dá)異源的木糖異構(gòu)酶和木酮糖激酶，將木糖異構(gòu)為木酮糖，再磷酸化為5-磷酸木酮糖；
(3)生成的5-磷酸木酮糖通過(guò)谷氨酸棒狀桿菌本身具有的磷酸戊糖途徑和糖酵解途徑可以生成α-酮戊二酸，將α-酮戊二酸脫氫酶進(jìn)行弱化表達(dá)，使α-酮戊二酸更多的流向谷氨酸的合成；
(4)對(duì)谷氨酸分泌蛋白進(jìn)行修飾，使谷氨酸棒狀桿菌不再響應(yīng)外界生物素壓力，持續(xù)將谷氨酸分泌到胞外。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種在谷氨酸棒狀桿菌中利用木糖生成谷氨酸的合成路徑的構(gòu)建方法，其特征在于：具體包括如下步驟：
(1)xylAB表達(dá)框整合至C.glutamicum的ldhA基因位點(diǎn)處；
(2)谷氨酸分泌通道蛋白的修飾；
(3)弱化α-酮戊二酸脫氫酶的表達(dá)；
(4)表達(dá)異源戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白araE。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種在谷氨酸棒狀桿菌中利用木糖生成谷氨酸的合成路徑的構(gòu)建方法，其特征在于：
所述步驟(1)xylAB表達(dá)框整合至C.glutamicum的ldhA基因位點(diǎn)處：先構(gòu)建xylAB的整合質(zhì)粒，接著通過(guò)電轉(zhuǎn)的方式將xylAB的整合質(zhì)粒pK18-ΔldhA::xylAB轉(zhuǎn)入C.glutamicum中，進(jìn)而通過(guò)pcr驗(yàn)證的方式篩選出發(fā)生正確同源重組的菌株，得到重組谷氨酸棒狀桿菌，命名為C.glutamicum XyltoGA01；
所述步驟(2)谷氨酸分泌通道蛋白的修飾：先構(gòu)建MscCG碳端330個(gè)堿基的敲除質(zhì)粒，接著通過(guò)電轉(zhuǎn)的方式將敲除質(zhì)粒pK18-ΔMscCG330轉(zhuǎn)入C.glutamicum XyltoGA01，進(jìn)而通過(guò)pcr驗(yàn)證的方式篩選出發(fā)生正確同源重組的菌株，得到重組谷氨酸棒狀桿菌，命名為C.glutamicum XyltoGA02；
所述步驟(3)弱化α-酮戊二酸脫氫酶的表達(dá)：先構(gòu)建替換odhA的原始RBS序列為轉(zhuǎn)錄起始強(qiáng)度為0.1的RBS序列的整合質(zhì)粒，接著通過(guò)電轉(zhuǎn)的方式將敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)入C.glutamicumXyltoGA02，進(jìn)而通過(guò)pcr驗(yàn)證的方式篩選出發(fā)生正確同源重組的菌株，得到重組谷氨酸棒狀桿菌，命名為C.glutamicum XyltoGA03；
所述步驟(4)表達(dá)異源戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白araE：先構(gòu)建araE的整合質(zhì)粒，接著通過(guò)電轉(zhuǎn)的方式將araE的整合質(zhì)粒pK18-Δack::araE轉(zhuǎn)入C.glutamicum XyltoGA03中，進(jìn)而通過(guò)pcr驗(yàn)證的方式篩選出發(fā)生正確同源重組的菌株，得到的重組谷氨酸棒狀桿菌命名為C.glutamicum XyltoGA04。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述一種在谷氨酸棒狀桿菌中利用木糖生成谷氨酸的合成路徑的構(gòu)建方法，其特征在于：將重組菌株C.glutamicum XyltoGA04培養(yǎng)發(fā)酵，培養(yǎng)基為含有60g/L葡萄糖和40g/L木糖的高生物素濃度培養(yǎng)基，溫度為32℃，pH用氨水控制在7.2，通氣量為1.4vvm，轉(zhuǎn)速為600rpm。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法構(gòu)建的可以在高生物素的環(huán)境中利用木糖高產(chǎn)谷氨酸的谷氨酸棒狀桿菌。
6.權(quán)利要求5所述在高生物素的環(huán)境中利用木糖高產(chǎn)谷氨酸的谷氨酸棒狀桿菌在木質(zhì)纖維素發(fā)酵中的應(yīng)用。
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