[發明專利]用于快速制備感染性RNA病毒的方法

在審

• 申請號: 202011324613.2
• 申請日: 2015-06-19
• 公開（公告）號: CN112501138A
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發明（設計）人: F·奧布里;A·努加德雷;G·奎拉特;X·德朗巴勒瑞;E·A·古德;L·德法布里圖斯
• 申請（專利權）人: 埃克斯-馬賽大學;國家醫療保健研究所
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01
• 代理公司: 北京市金杜律師事務所 11256
• 代理人: 孟凡宏;袁森

本發明涉及用于快速制備感染性RNA病毒的方法，其完全不需要構建覆蓋整個病毒基因組的全長cDNA、克隆和繁殖該全長cDNA。

本申請是申請日為2015年6月19日、申請號為“201580033090.7”、發明名稱為“用于快速制備感染性RNA病毒的方法”的發明專利申請的分案申請。

技術領域

本發明涉及用于快速制備感染性RNA病毒的方法，其完全不需要構建全長cDNA、克隆并繁殖該全長cDNA。

背景技術

通過允許“反向基因組學”(即，研究具體突變對病毒的生物學性質的影響)的發展，能夠從其基因組的DNA拷貝產生感染性病毒的分子學方法的發展極大地提高了我們對RNA病毒的生命周期和發病機制的理解。

然而，目前用于構建感染性cDNA克隆的方法是不可預料且費力的方法，其常常與細菌中不期望的突變或不穩定/有毒的克隆有關。

這產生了對制備RNA病毒的其他方法的極大興趣。已經提出了各種方法改進，例如使用可選擇的宿主、低拷貝數的質粒、粘粒載體、細菌人工染色體、具有降低的隱藏細菌啟動子活性的修飾啟動子或修飾病毒基因組序列。

Gritsun和Gould于1995年用蜱傳播腦炎(TBEV)，以及Edmonds等和Siridechadilok等于2013年分別用西尼羅病毒 (WNV)和登革病毒(DENV)發展了不含細菌的方法。

盡管他們代表顯著的進步，這些方法對研究的各個病毒需要實質性的優化，且沒有提供統一的方法論過程。

因此，對于有效、精確且快速的用于制備感染性RNA病毒的其他方法存在長期未滿足的需要。

發明簡述

發明人已經表明，各自覆蓋RNA病毒基因組的一部分的重疊cDNA片段能夠產生復制型病毒而不使用全長cDNA或含有該全長cDNA的質粒或載體。

因此，發明人公開了各自覆蓋病毒基因組的一部分的重疊雙鏈DNA片段能夠在細胞中自發重組并合成完整病毒基因組的DNA拷貝。

因此，在第一個方面，本發明涉及用于制備感染性RNA病毒的方法，包含以下步驟：

a)將DNA依賴性RNA聚合酶的啟動子引入RNA病毒的整個基因組的5’位，和任選地將終止子和RNA聚腺苷酸序列引入RNA病毒的整個基因組的3’位；

b)在至少2個、優選至少3個、4個、5個或6個重疊cDNA片段中擴增步驟a)制備的整個病毒基因組，其包括所述啟動子和任選的所述終止子和RNA聚腺苷酸序列；

c)將所述cDNA片段轉染入宿主細胞；

d)孵育步驟c)的宿主細胞；和

e)從所述孵育的宿主細胞回收感染性RNA病毒。

在第二個方面，本發明涉及在此公開的用于制備感染性RNA病毒的方法，和/或根據所述方法獲得的RNA病毒用于反向基因組學分析的用途。

在第三個方面，本發明涉及在此公開的用于制備感染性RNA病毒的方法，和/或根據所述方法獲得的RNA病毒用于安全有效地運送感染性RNA病毒的用途。

發明詳述

發明人發現，各自覆蓋病毒基因組的一部分的重疊雙鏈DNA片段能夠在轉染后自發重組并合成完整病毒基因組的DNA拷貝。基于這一出乎意料的發現，發明人開發了用于制備感染性RNA病毒的新方法，其不需要將全長cDNA克隆并繁殖入細菌。

因此，在第一個方面，本發明涉及用于制備感染性RNA病毒的方法，包含以下步驟：