[發明專利]滑膜肉瘤類器官的培養方法和培養基以及移植體及其用途

有效

• 申請號: 202011323451.0
• 申請日: 2020-11-23
• 公開（公告）號: CN112481214B
• 公開（公告）日: 2022-07-05
• 發明（設計）人: 黃穩定;嚴望軍;李程;肖金平;程默;蔡維濼;孫志堅;康平
• 申請（專利權）人: 北京科途醫學科技有限公司;浙江科途醫學科技有限公司
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;A01K67/027
• 代理公司: 北京英創嘉友知識產權代理事務所(普通合伙) 11447
• 代理人: 耿超

1.一種培養滑膜肉瘤類器官的方法，其特征在于，該方法包括：

依次利用分離培養基和擴增培養基對滑膜肉瘤組織細胞進行分離、擴增培養，得到擴增培養產物；其中，所述分離培養基中含有丙戊酸，以所述分離培養基為基準，所述丙戊酸的濃度為2～3mmol/l；所述擴增培養基中含有丙戊酸，以所述擴增培養基為基準，所述丙戊酸的濃度為0.5～1.5mmol/l；

對所述擴增培養產物進行分離處理，得到細胞沉淀；

利用所述擴增培養基對所述細胞沉淀進行傳代培養，得到傳代培養產物；

獲取所述傳代培養產物中的固體部分，得到滑膜肉瘤類器官；

所述分離培養基中還含有5～20體積%的FBS、50～200U/ml的青霉素 G、50～200mg/ml的鏈霉素，1～10體積%的B27、1～10mM的煙酰胺、1～20μM的Y-27632、10～50μM的EGF、10～50μM的bFGF和余量的Leibovitz’s L-15培養基；

所述擴增培養基中還含有5～20體積%的FBS、50～200U/ml的青霉素 G、50～200mg/ml的鏈霉素，1～10體積%的B27、1～10mM的煙酰胺、10～50μM的EGF、10～50μM的bFGF和余量的Leibovitz’s L-15培養基。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述依次利用分離培養基和擴增培養基對滑膜肉瘤組織細胞進行分離、擴增培養，得到擴增培養產物，包括：

將所述滑膜肉瘤組織細胞與所述分離培養基和基質膠混合，得到原代培養物，其中，所述原代培養物中，所述滑膜肉瘤組織細胞的濃度為1×10⁴～5×10⁴個/mL，所述基質膠的含量為分離培養基總體積的5～20%；

對所述原代培養物進行培養24～48h后，將所述擴增培養基補加至所述原代培養物的培養體系中，所述擴增培養基的補加量為所述原代培養物的培養體系的25～50體積%，繼續培養所述原代培養物，直至其中60～80%細胞團的直徑達到0.1～0.3mm，得到所述擴增培養產物。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述利用所述擴增培養基對所述細胞沉淀進行傳代培養，得到傳代培養產物，包括：

將所述細胞沉淀與所述擴增培養基和基質膠混合，得到傳代培養物，其中，所述傳代培養物中，所述細胞沉淀的濃度為1×10³～5×10³個/mL，所述基質膠的含量為擴增培養基總體積的2～10%；

對所述傳代培養物進行傳代擴增培養，得到所述傳代培養產物，其中，在所述傳代擴增培養過程中，每隔2～3天，向培養體系中添加培養體系總體積的10-20%的所述擴增培養基。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述滑膜肉瘤組織細胞由滑膜肉瘤組織經酶解處理得到，其中，所述滑膜肉瘤組織保存于滑膜肉瘤保護液中，所述滑膜肉瘤保護液中含有兩性霉素 B、青鏈霉素和Leibovitz’s L-15培養基，以所述滑膜肉瘤保護液為基準，所述兩性霉素 B的用量為5～20μg/ml，所述青鏈霉素的用量為80～200μg/ml，余量為所述Leibovitz’s L-15培養基；

所述酶解處理包括：

將所述滑膜肉瘤組織與酶解液混合，得到待酶解物，其中，所述酶解液中含有FBS、分散酶、DNAse、Ⅰ型膠原酶、青鏈霉素和DMEM培養基，以所述酶解液為基準，所述FBS的含量為1～10體積%，所述分散酶的含量為0.1～1體積%，所述DNAse的含量為0.01～1體積%，所述Ⅰ型膠原酶的濃度為0.5～10mg/ml，所述青鏈霉素的含量為1～5體積%，余量為所述DMEM培養基；

將所述待酶解物進行培養酶解0.5～2h，得到酶解產物；

對所述酶解產物進行分離處理，得到所述滑膜肉瘤組織細胞。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，以所述分離培養基為基準，所述丙戊酸的濃度為2.4～2.8mmol/l；

以所述擴增培養基為基準，所述丙戊酸的濃度為0.8～1.2mmol/l。