[發明專利]一種精準定量的ATAC-seq文庫制備方法及試劑盒

有效

• 申請號: 202011321903.1
• 申請日: 2020-11-23
• 公開（公告）號: CN112410403B
• 公開（公告）日: 2022-04-22
• 發明（設計）人: 李華;俞振勛;弓晉欣;胥政昊
• 申請（專利權）人: 蘇州京脈生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C40B50/06;C12N15/10
• 代理公司: 江蘇昆成律師事務所 32281
• 代理人: 劉尚軻

本申請提供一種精準定量的ATAC?seq文庫制備方法及試劑盒，包括兩種銜接子，第一銜接子為5`?S1?S2?S3?S4?3`，第二銜接子為5`?S5?S6?S7?S8?3`，其中,所述S1為第一測序引物，S2為隨機標簽序列，S2的堿基為A、T、G、C中的一種或多種的隨機組合，S2的堿基的數量為1?95的任一整數，S3為固定序列，所述S4與S8的堿基序列相同，為Tn5轉座子固定序列，S5為第二測序引物，S6為隨機標簽序列，S6的堿基為A、T、G、C中的一種或多種的隨機組合，S6的堿基的數量為1?100的任一整數，S7為另一固定序列，將所述兩種銜接子與Tn5酶進行孵育得到轉座復合體；再將轉座復合體與測試樣本進行孵育，得到擴增模板；將所述擴增模板進行PCR擴增，得到測序文庫。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，更具體地，涉及一種精準定量的ATAC-seq文庫制備方法及試劑盒。

背景技術

目前我們可以通過轉座酶可及染色體(ATAC)測定，來研究基因組中開放染色質區域，開放染色質區域是轉錄因子與轉錄元件的重要結合位點。目前用于研究開放染色質區域的方法有：1.DNase-seq，將裸露的DNA片段用DnaseI內切酶切割，對切割完的DNA片段進行測序，與已知的全基因組序列進行比對，就能發現被切割掉的區域是哪部分，可以找到開發染色質區域，但是該方法操作繁瑣、時間長(2-3天)，需要大量的細胞核用于實驗(一百萬以上個細胞核)，并且重復性也較差。2.ATAC-seq(Assay for Transposase-AccessibleChromatin using sequencing運用測序手段研究轉座酶可接近的染色質的實驗)，利用Tn5轉座酶直接處理細胞核，該方法操作簡單、幾個小時就能完成，需要的細胞核的量少，只需要500個細胞核即可完成建庫測序，也能夠更好的保證重復性，因此得到廣泛的應用。

目前市場上用于ATAC高通量文庫制備的主流試劑盒有Illumina公司Nextera系列等。這些試劑盒能滿足不同的植物樣品來源，最大程度的滿足了科研應用，但是，目前市場上還沒有一種完成精準定量的文庫制備的方法，常規的ATAC-seq文庫中的建庫方法實驗過程中仍然存在系統性誤差，尤其在針對少量樣品時，需要增加測序量來提高檢測的準確性，而這種情況下數據的重復率會大幅增加，限制了該方法應用于精準醫學和疾病預測的等其他需要。因此，需要建立一種精準定量的ATAC-seq文庫制備方法及試劑盒。

發明內容

本發明的目的在于，提供一種精準定量的ATAC-seq文庫制備方法及試劑盒，實現精準定量。

本申請的第一方面，涉及一種精準定量的ATAC-seq文庫制備方法，所述方法包括：

(a)提供兩種銜接子，第一銜接子為5`-S1-S2-S3-S4-3`，第二銜接子為5`-S5-S6-S7-S8-3`，其中,所述S1為第一測序引物，S2為隨機標簽序列，S2的堿基為A、T、G、C中的一種或多種的隨機組合，S2的堿基的數量為1-95的任一整數，S3為固定序列，所述S4與S8的堿基序列相同，為Tn5轉座子固定序列，S5為第二測序引物，S6為隨機標簽序列，S6的堿基為A、T、G、C中的一種或多種的隨機組合，S6的堿基的數量為1-100的任一整數，S7為固定序列；將所述兩種銜接子與Tn5酶進行孵育得到轉座復合體；

(b)再將轉座復合體與測試樣本進行孵育，得到擴增模板；

(c)將所述擴增模板進行PCR擴增，得到測序文庫。

在一些實施方式中，在步驟(a)中，所述S1為5`-TGTGAGAAATCTAGCATACGACTTCGTC-3`(SEQ ID NO:1),S3為5`-GCGATCGC-3`,S4和S8的堿基序列為5`-AGATGTGTATAAGAGACAG-3`(SEQ ID NO:2),S5為5`-CTGACTCCACACTGTAGAAGCCATGACACGG-3`(SEQ ID NO:3),S7為5`-CACCGTGCTC-3`(SEQ ID NO:4)，S2的堿基的數量為10-50的任一整數。