[發明專利]一種精準定量的ATAC-seq文庫制備方法及試劑盒

有效

• 申請號: 202011321903.1
• 申請日: 2020-11-23
• 公開（公告）號: CN112410403B
• 公開（公告）日: 2022-04-22
• 發明（設計）人: 李華;俞振勛;弓晉欣;胥政昊
• 申請（專利權）人: 蘇州京脈生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C40B50/06;C12N15/10
• 代理公司: 江蘇昆成律師事務所 32281
• 代理人: 劉尚軻

1.一種精準定量的ATAC-seq文庫制備方法，其特征在于，所述方法包括：

(a)提供兩種銜接子，第一銜接子為5`-S1-S2-S3-S4-3`，第二銜接子為5`-S5-S6-S7-S8-3`，其中,所述S1為第一測序引物，S2為隨機標簽序列，S2的堿基為A、T、G、C中的一種或多種的隨機組合，S2的堿基的數量為15-30的任一整數，S3為固定序列，所述S4與S8的堿基序列相同，為Tn5轉座子固定序列，S5為第二測序引物，S6為隨機標簽序列，S6的堿基為A、T、G、C中的一種或多種的隨機組合，S6的堿基的數量為15-100的任一整數，S7為固定序列；將所述兩種銜接子與Tn5酶進行孵育得到轉座復合體；

(b)再將轉座復合體與測試樣本進行孵育，得到擴增模板；

(c)將所述擴增模板進行PCR擴增，得到測序文庫；

其中，所述方法包括選自下組的一個或多個特征：

(1)在步驟(a)中，所述S1為5`-TGTGAGAAATCTAGCATACGACTTCGTC-3`,S3為5`-GCGATCGC-3`,S4和S8的堿基序列為5`-AGATGTGTATAAGAGACAG-3`,S5為5`-CTGACTCCACACTGTAGAAGCCATGACACGG-3`,S7為5`-CACCGTGCTC-3`；

(2)在步驟(a)中，兩種銜接子與Tn5酶混合前，將單鏈的第一銜接子和第二銜接子與單鏈M退火雜交形成雙鏈銜接子，單鏈M的序列為5'-CTGTCTCTTATACACATCT-3；將Tn5酶與合成的雙鏈銜接子按照1：1的摩爾比進行混合，然后進行孵育，得到轉座復合體；

(3)在步驟(b)中，轉座復合體與測試樣本進行孵育，得到含“銜接子-核酸-銜接子”復合物的混合物，將該混合物進行純化，得到擴增模板；

(4)在步驟(c)中，將擴增模板用能夠特異性結合于第一銜接子的第一引物Primer1和特異性結合與第二銜接子的第二引物Primer2進行PCR反應，獲得擴增產物，其中，Primer1的結構為P1-I1-P2，P1為：5`-AATGATACGGCGACCACCGAGATCT-3`，I1為測序標簽序列，P2為:5`-ACACTCTTTAGATCGTATGCTGAAGCAG-3`，Primer2的結構為P3-I2-P4，其中P3為5`-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-3`，I2為測序標簽序列，P4為5`-GACTGAGGTGTGACATCTTCGGTACTGTGCC-3`。

2.如權利要求1所述的精準定量的ATAC-seq文庫制備方法，其特征在于，在步驟(b)中，測試樣本為植物或動物的細胞核，測試樣本的細胞核的數量為500-10000個。

3.如權利要求1所述的精準定量的ATAC-seq文庫制備方法，其特征在于，在步驟(c)中，所述I1選自：CTCTCTAT，TATCCTCT，AGAGTAGA，GTAAGGAG，ACTGCATA，AAGGAGTA，CTAAGCCT中的一種，所述I2選自：GCATGATC，TCCGTCTT，AGGACTCG，CCTGAGGA，ATCCGTAC，GAGAGATG，GTCTCTCC中的一種。

4.如權利要求1所述的精準定量的ATAC-seq文庫制備方法，其特征在于，擴增產物需要進行純化，然后得到測序文庫。

5.如權利要求1所述的精準定量的ATAC-seq文庫制備方法，其特征在于，所述測序文庫進行片段長度范圍檢測和濃度定量后即可進行二代測序，然后進行數據分析。

6.一種精準定量的ATAC-seq文庫制備試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：第一銜接子和第二銜接子，第一銜接子為5`-S1-S2-S3-S4-3`，第二銜接子為5`-S5-S6-S7-S8-3`，所述S1為第一測序引物，S2為隨機標簽序列，S2的堿基為A、T、G、C中的一種或多種的隨機組合，S2的堿基的數量為15-30的任一整數，S3為一固定序列，所述S4與S8的堿基序列相同，為Tn5轉座子固定序列，S5為第二測序引物，S6的堿基為A、T、G、C中的一種或多種的隨機組合，S6的堿基的數量為15-100的任一整數，S7為另一固定序列。