[發(fā)明專利]多樣性抗體產(chǎn)生細胞的細胞庫及其用途

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202011321145.3
• 申請日: 2020-11-23
• 公開（公告）號: CN114525591A
• 公開（公告）日: 2022-05-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 汪曉靜
• 申請（專利權(quán)）人: 祥德生物醫(yī)藥(上海)有限公司
• 主分類號: C40B40/02
• 分類號: C40B40/02;C12N5/10;C12N15/85;C12N15/55;C12N15/13;C12P21/00
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 陶啟長;韋東

本發(fā)明提供一種多樣型抗體產(chǎn)生細胞的細胞庫，所述細胞庫中的抗體產(chǎn)生細胞的抗體基因包含多種抗體重鏈可變區(qū)的編碼序列。其中，所述抗體重鏈可變區(qū)包含來自不同供體細胞的抗體重鏈可變區(qū)基因的重鏈V區(qū)段、重鏈D區(qū)段、或重鏈J區(qū)段，或其任意組合。本發(fā)明還提供擴展抗體產(chǎn)生細胞的細胞庫多樣性的方法、制備多樣型抗體產(chǎn)生細胞的細胞庫的方法和體外進化篩選生產(chǎn)具有抗原特異性活性的抗體的細胞的方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及抗體體外自發(fā)演化領(lǐng)域，具體涉及可體外演化的多樣性抗體產(chǎn)生細胞的細胞庫及其用途。

背景技術(shù)

獲得性免疫系統(tǒng)是人體控制病原體的重要防御機制。這其中，抗體由于其在體內(nèi)可以針對每個病原體進行針對性的優(yōu)化并找尋到最具保護效應(yīng)的分子而顯得尤為重要。在病毒或其他微生物感染時，人體經(jīng)過百萬年的進化，發(fā)展出了一套在淋巴器官內(nèi)對B細胞進行高效的分子演化，可以于數(shù)天內(nèi)開發(fā)出針對感染源的特異性抗體，幫助個體抵御疾病。近30年，抗體的藥用潛力在得到了巨大發(fā)展，已遠遠超越了簡單的抗感染免疫。全球市場上銷售額最高的前20種藥物中，有幾近一半是生物類藥物。這其中抗體藥物又是其中最重要的組成部分。盡管抗體藥最早期往往是鼠源的，抗藥抗體的嚴重問題推動整個領(lǐng)域經(jīng)過長期技術(shù)改造發(fā)展為現(xiàn)今以人源化抗體為主流的構(gòu)架。然而從鼠源抗體藥物候選改造人員化的過程存在很大的不確定性，又消耗大量資源，人源抗體的篩選平臺的探索在近20年是抗體生物制藥業(yè)的一個重要研究課題。人源抗體噬菌體展示庫，人源化小鼠和人外周血單細胞克隆技術(shù)都是這個方向的重要成果。

然而，由于原代B細胞無法在體外長期培養(yǎng)，更無法進行類似體內(nèi)的受控基因組突變過程，至本發(fā)明前，抗體的高效的分子進化過程只能在生物體內(nèi)完成，無法在體外有效的仿制。現(xiàn)有的所有人源抗體篩選技術(shù)也都以動物載體體內(nèi)免疫，體外被動篩選為主，由于牽涉免疫原選擇，免疫途徑優(yōu)化，動物血清篩選等多個步驟，研發(fā)周期長且無法適應(yīng)快速應(yīng)對大規(guī)模流行病類應(yīng)用的需求。

B細胞定向突變與抗體基因所在的染色體環(huán)境有緊密關(guān)聯(lián)但對基因序列本身的容忍性較高，因此，如果將一個外源基因嵌入到抗體基因可變區(qū)，該嵌入基因也可以通過B細胞高效的體細胞突變機制來進行分子演化。這些外源基因可以是單域抗體、非人源抗體基因，單鏈抗體，或藥物受體等任何生物活性分子。

人源B細胞系Ramos是目前唯一一株可以在體外持續(xù)穩(wěn)定的對抗體基因進行突變的細胞系。該細胞系是從成熟B細胞來源的淋巴細胞腫瘤中分離獲得，表達重組后的3-23抗體重鏈基因，產(chǎn)生IgM抗體。通過3-4輪自然演化和定向篩選，該細胞被證明可以演化出針對鏈霉親和素的特異抗體(Nature Biotechnology 20,1129-1134(2002))。然而，人體中抗體庫多樣性是分步完成的：從前-B細胞到成熟B細胞的VDJ重排是第二階段感染中生發(fā)中心進行抗體基因體細胞高效突變產(chǎn)生抗病原微生物抗體的基礎(chǔ)。Ramos細胞僅表達一個重組完全的重鏈抗體基因，從這個單一的VDJ重組源頭出發(fā)，可針對的抗原種類也將受到極大限制。此外抗體功能與抗體恒定區(qū)亞型也有很大關(guān)聯(lián)，因此如何將Ramos細胞應(yīng)用于IgG抗體個亞型的篩選也是一個空白。

另一方面，由于Ramos細胞本身的抗體基因定向突變效率比體內(nèi)B細胞在感染過程中的天然機理低約100倍，僅利用該細胞本身進行演化的效率低下，不能滿足制藥研發(fā)的需要。事實上，雖然B細胞在體內(nèi)可以在7-14天內(nèi)演化出針對未知抗原的高親和力抗體，但未經(jīng)改造的Ramos細胞在體外需要3-4個月才有可能得到類似產(chǎn)物。此外，為保持抗體庫的多樣性，抗體演化過程將不會丟棄任何細胞。這將使的演化抗體庫在短時間內(nèi)超過數(shù)十億級的細胞，而對目的抗原高反應(yīng)的抗體可能只有有限的數(shù)個。本領(lǐng)域不知曉何種技術(shù)平臺可以高效分離擴增這樣的高反應(yīng)性單克隆細胞。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明首次描述了在體外B細胞中進行抗體優(yōu)化的系統(tǒng)，完成類似B細胞體內(nèi)淋巴器官分子演化的過程，給予研究者體外模擬體液免疫反應(yīng)過程的推演，極大加快功能性人源抗體的開發(fā)和利用。

本發(fā)明第一方面提供一種多樣型抗體(Ig)產(chǎn)生細胞的細胞庫，所述細胞庫中的抗體產(chǎn)生細胞的抗體基因包含多種抗體重鏈可變區(qū)的編碼序列。