[發明專利]一種高產大麻萜酚的釀酒酵母菌株及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 202011320403.6
• 申請日: 2020-11-23
• 公開（公告）號: CN112410235A
• 公開（公告）日: 2021-02-26
• 發明（設計）人: 張云豐;羅小舟
• 申請（專利權）人: 森瑞斯生物科技（深圳）有限公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/90;C12P7/22;C12R1/865
• 代理公司: 深圳市廣諾專利代理事務所(普通合伙) 44611
• 代理人: 祝晶

本發明公開了一種高產大麻萜酚的釀酒酵母菌株及其構建方法和應用。該高產大麻萜酚的釀酒酵母菌株通過基因編輯技術在產大麻萜酚的釀酒酵母菌株A中插入TKS和OAC酶得到。本發明通過基因編輯技術調控2，4?二羥基戊苯合成酶TKS和2,4?二羥基戊苯酸合成酶OAC的基因拷貝數，增加OLA的積累量。最終，平衡大麻萜酚酸合成前體GPP和OLA的代謝流量，達到高產大麻萜酚酸的目的。

技術領域

本發明涉及合成生物學技術領域，通過基因工程改造，獲得一株高產大麻萜酚酸的重組釀酒酵母菌株，特別是涉及一種高產大麻萜酚的釀酒酵母菌株及其構建方法和應用。

背景技術

無致幻副作用的大麻萜酚(Cannabigerol,CBG)在醫藥、食品、保健和化妝品等領域有重要的應用價值。CBG與人體CB1和CB2受體結合后行使諸如抗腫瘤、抗炎癥、抗氧化、保護神經、免疫調節及治療癌癥等功效。同時，CBG還對甲氧西林耐藥性的金黃色葡萄菌有殺菌效果。在大麻植物腺毛的基盤細胞中，液泡中聚酮化合物途徑利用脂肪酸合成二羥基戊苯酸(Olivetolic acid,OLA)，質體中的甲羥戊酸途徑利用乙酰基輔酶A合成牻牛兒焦磷酸(geranyl pyrophosphate,GPP)。進一步，香葉基轉移酶將GPP和OLA縮合形成大麻萜酚酸(cannabigerolic acid,CBGA)。大麻萜酚酸經過脫羧處理后獲得大麻萜酚產物。2006年，Taura等從C.sativa中鑒定了植物來源的二羥基戊苯合酶(Olivetol synthase,OLS)，其在OLA合成途徑中被命名為TKS。Gagne等鑒定出了OLA環化酶(OLA cyclase,OAC)(Gagne etal.,2012)。在釀酒酵母中以己酰輔酶A為前體，TKS(Taura等鑒定的OLS酶)和OAC酶可合成了0.5mg/L OLA。2016年，Kathleen等從大麻植物Cannabis sativa L.的腺毛cDNA中擴增到具有GPP:OA異戊烯轉移酶功能的蛋白PT3。利用釀酒酵母底盤細胞合成GPP的特點，可在釀酒酵母體內表達異戊烯轉移酶和OLA合成途徑獲得大麻萜酚酸產物。

但是，現在現有技術中存在以下幾個問題：第一，在釀酒酵母中不能協調大麻萜酚酸合成途中的代謝前體GPP和OLA的合成量，最終導致大麻萜酚酸產量低的問題；第二，不能在釀酒酵母中大量積累OLA代謝產物用于合成大麻萜酚酸。

因此，市面上亟需一種能夠解決上述一個或者多個問題的一種高產大麻萜酚的釀酒酵母菌株及其構建方法和應用。

發明內容

為解決現有技術中存在的一個或者多個問題，本發明提供了一種高產大麻萜酚的釀酒酵母菌株及其構建方法和應用。

本發明為達到上述目的所采用的技術方案是：一種高產大麻萜酚的釀酒酵母菌株的構建方法，所述方法包括：

步驟01、構建一株產大麻萜酚的釀酒酵母菌株A；

步驟02、通過基因編輯技術在產大麻萜酚的釀酒酵母菌株A中插入TKS酶和OAC酶，獲得高產大麻萜酚的釀酒酵母菌株B。

在一些實施例中，所述方法還包括：

步驟03、在高產大麻萜酚的釀酒酵母菌株B中篩選OAC酶的表達啟動子獲得最佳表達啟動子，并利用最佳表達啟動子插入2個拷貝數的OAC基因，獲得高產大麻萜酚的釀酒酵母菌株C。

在一些實施例中，所述步驟02包括：

步驟21、以產大麻萜酚的釀酒酵母菌株A為基礎，通過引物F1/R1進行PCR擴增得到1622位點上游1000bp同源臂片段1622b-Up，引物F2/R2進行擴增獲得融合的TKS-OAC片段，引物F3/R3進行擴增獲得1622b位點下游1000bp同源臂片段1622b-Down；

步驟22、通過醋酸鋰/PEG3350化學轉化方法，將上述3個片段轉化產大麻萜酚的釀酒酵母菌株A；